Wpływ deprywacji tlenowo-glukozowej i reoksygenacji na interakcje komórka-komórka

Streszczenie

Źródło: Alluri, H., et.al. Deprywacja tlenowo-glukozowa i redotlenowacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg. J. Vis. Exp. (2015).

Film pokazuje wpływ niedoboru tlenu i glukozy oraz późniejszego dotlenienia na komórki mikronaczyniowe śródbłonka mózgu szczura (RBMEC) poprzez symulację stanu niedotlenienia i braku składników odżywczych. Warunki te powodują zubożenie ATP, zwiększenie wewnątrzkomórkowego wapnia i wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS), które degradują białka połączeń komórkowych i indukują tworzenie włókien stresowych, osłabiając w ten sposób interakcje komórka-komórka.

Protokół

1. Wysiewanie komórek śródbłonka

1. Zdobądź podstawowe kultury RBMEC od dorosłych szczurów Sprague Dawley (lub zdobądź je komercyjnie).

2. Hoduj RBMEC na 100 cm pokrytych fibronektyną (50 μg/ml) szalkach Petriego, używając pożywki do wzrostu komórek śródbłonka mózgu szczura. Zmieniaj podłoże co dwa dni, aż do osiągnięcia konfluencji.

3. Po osiągnięciu 80-90% zbiegu delikatnie umyj komórki w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), mieszając. Komórki są następnie odłączane, wystawiając je na działanie 1 ml ciepłego 0,25% roztworu kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), w proporcji do 37 °C.

4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut, aż komórki zostaną odłączone i rozproszone. UWAGA: Dotknij naczynia hodowlanego, aby odłączyć komórki. Obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić całkowite oderwanie komórek od powierzchni naczynia.

5. Dodać 5 ml kompletnej pożywki na szalkę Petriego w celu zneutralizowania trypsyny. Odpipetować pożywkę zawierającą oderwane komórki i zebrać ją do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.

6. Odwirować pożywkę zawierającą komórki śródbłonka w sile 220 x g przez 5 minut.

7. Odessać supernatant i zakonserwować komórki zawierające osad. Zawiesić osad w 3-5 ml świeżej pożywki do wzrostu komórek śródbłonka mózgu szczura, delikatnie mieszając go w górę iw dół za pomocą pipety. Komórki zostaną następnie zliczone za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.

8. Przenieś zawiesinę komórek do wstępnie powlekanego systemu szkiełek sterylnych z fibronektyną (50 μg/ml) o objętości 0,7 cm kwadratowych / studzienkę o gęstości wysiewu w zakresie od 10 000 do 15 000 komórek na studzienkę. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia konfluencji UWAGA: W celu przeprowadzenia western blot lub innych eksperymentów, komórki można hodować w 10-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych lub specjalnych szalkach, zgodnie z wymaganiami eksperymentu.

2. Deprywacja tlenu i glukozy-reoksygenacja w modelu in vitro

1. Użyj systemu hodowli komórek hipoksji, aby zbadać wpływ OGD-R na RBMEC (patrz Rysunek 1). Ustaw i skalibruj system hodowli komórek hipoksji przed rozpoczęciem eksperymentu, zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Wyjąć szkiełka z komorą zlewającą się (krok 1.8) z inkubatora w temperaturze 37 °C. Zastąp całe podłoże w szkiełku komory odtlenionym, bez glukozy, zmodyfikowanym podłożem Orła (DMEM) firmy Dulbecco i umieść w komorze hipoksji z 95% azotem i 5% dwutlenkiem węgla na 2 godziny w temperaturze 37 °C, aby przedstawić stan OGD.

3. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora z 95% tlenem, 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 °C i zaopatrzone w świeżą pożywkę z komórek śródbłonka mózgu szczura i inkubować przez kolejną 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

UWAGA: Ten krok reprezentuje sytuację ponownego natlenienia.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, bez glukozy	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 well sterylne, szkiełka szklane	Thermo scientific	177402
Anty-królik wtórny z tagiem FITC przeciwciało	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Można użyć dowolnego innego PBS dostępnego