Immunoprecypitacja chromatyny natywnej komórek neurosfery

Streszczenie

Źródło: Mendez, F. M. i inni., Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film pokazuje izolację kompleksów białko-DNA z komórek neurosfery pochodzących z guza mózgu myszy przy użyciu natywnej immunoprecypitacji chromatyny. Szczegółowo opisuje etapy przygotowania chromatyny, immunoprecypitacji, płukania i trawienia białek w celu uwolnienia DNA do dalszej analizy.

Protokół

1. Natywna immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)

1. Przygotowanie chromatyny
   1. Po zinwentaryzowaniu pochodnych komórek neurosfery (NS), hoduj NS w kolbie T-75 w 15 ml pożywki NSC w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych w atmosferze 95% powietrza i 5% CO₂ , aż NS staną się zlewne. Jedna zlewająca się płytka T-75 da 3-5 X 10⁶ komórek.
   2. Gdy komórki zaczną się zlewać, odwirować NS przy 300 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i dodać 1 ml pożywki dysocjacyjnej komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 5 ml pożywki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: Na reakcję immunoprecypitacji (IP) potrzeba 10 x 10⁶. Należy pamiętać, że należy również dołączyć surowicę przedimmunologiczną lub kontrolę IgG.
   3. Odwirować NS w jednej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przy 300 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad NS z 1 ml zbilansowanego roztworu soli i przenieść zawiesinę do probówek mikrowirówek o niskiej wiązalności białka 1,5 ml.
   4. Odwirować NS przy 300 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 95 μl buforu do wytrawiania (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl₂, 0,2% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego) na 1 x 10⁶ komórek uzupełnionych koktajlem inhibitorów proteazy o wysokim stężeniu (1:100). Natychmiast pipetuj komórki w górę iw dół, aby zapobiec zbrylaniu się i tworzeniu pęcherzyków.
   5. Ponownie zawiesić nukleazę mikrokokową (MNazę) w 50% glicerolu, aby uzyskać roztwór 1 mg/ml (1,15 jednostki/μl, przechowywany w temperaturze -20 °C), który będzie określany jako "1x" zapas. Zrób "0,1x" zapas, wykonując drugie rozcieńczenie 1:9 z 50% glicerolem (e.g., 900 μL "1x" MNazy i 100 μL 50% glicerolu) i przechowuj go w temperaturze -20 °C.
   6. Wymieszaj 5 μL "0,1x" MNazy i 145 μl buforu wytrawiającego. Utrzymuj enzym na lodzie przez cały czas. Dodać 5 μl rozcieńczonej MNazy do buforu wytrawiającego na 1 x 10⁶ komórek. Przesuń probówkę, aby wymieszać i umieść probówkę w bloku o temperaturze 37 °C dokładnie na 12 minut. Przetwarzaj próbki pojedynczo, aby zapewnić dokładny czas inkubacji wynoszący 12 minut.
   7. Dodaj 10 μL 10x buforu zatrzymującego MNazę (110 mM Tris-HCl, pH 8,0, 55 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)) na 1 x 10⁶ komórek. Począwszy od tego momentu, próbki muszą być przechowywane na lodzie.
   8. Dodać 110 μl "2x bufor do oznaczania radioimmunoprecypitacji (RIPA)" (280 mM NaCl, 1,8% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego, 0,2% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 0,2% Na-deoksycholanu, 5 mM glikolu etylenowego-bis (eter β-aminoetylowy)-N,N,N',N'--tetraoctowy (EGTA); przechowywany w temperaturze 4 °C) uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy w wysokim stężeniu (1:100) na 1 x 10⁶ komórek. Przesuń rurkę, aby wymieszać.
   9. Odwirować probówki przez 15 minut w mikrodymie w temperaturze 4 °C i 1700 x g. Przenieść supernatant do nowej zwykłej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (probówki do mikrowirówek o niskiej wiązalności białka nie są już potrzebne) i przechowywać je na lodzie. Wyrzuć granulkę.
      
2. Immunoprecypitacja (IP)
   1. Wymieszaj kulki magnetyczne białka A i białka G w stosunku 1:1. Na każdy IP przygotuj 25 μl koralików.
   2. Przemyć kulki, dodając 1 ml buforu RIPA (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego, 0,1% SDS, 0,1% Na-deoksycholanu; przechowywanego w temperaturze 4 °C) uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu (1:1000).
   3. Użyj magnesu, aby kulki oddzieliły się od roztworu myjącego i zdekantuj roztwór myjący (około 1 minuty). Wykonaj krok prania dwukrotnie.
   4. Zawiesić kulki do pierwotnej objętości za pomocą buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy (1:1000).
   5. W razie potrzeby rozcieńczyć chromatynę za pomocą buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy (1:1000) tak, aby każdy IP miał objętość 100-200 μL. Na wejście należy zarezerwować 10% objętości chromatyny zużytej na IP.
      UWAGA: Na przykład, jeśli używa się 200 μL na IP, 20 μL rozcieńczonej chromatyny powinno być zarezerwowane na wejście. W przypadku łącznie czterech IP całkowitą objętość chromatyny należy rozcieńczyć do 820 μL.
   6. Przygotuj wejście. Dodać 100 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) uzupełnionego proteinazą K (0,5 mg/ml) do wejścia i inkubować wejście w temperaturze 55 °C przez 1 h.
   7. Oczyść wsad za pomocą zestawu do oczyszczania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) zgodnie z instrukcjami producenta i wymyj w 50 μl buforu elucyjnego dostarczonego w zestawie.
   8. Zmierz stężenie materiału wejściowego za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i zapisz wyniki w notatniku. Ślepa próba z buforem elucyjnym z zestawu.
      UWAGA: W neurosferach myszy użyliśmy około 6 μg DNA dla każdego IP.
   9. Uruchom dane wejściowe na 1% żelu lub załaduj 1 μl do bioanalizatora DNA przy użyciu standardowych ustawień. Pozostałą część należy przechowywać do wykorzystania jako dane wejściowe w dalszych aplikacjach.
   10. Dodaj 10 μL umytych kulek magnetycznych białka A i G dla każdego IP i inkubuj IP przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
       UWAGA: Na przykład dodaj 30 μL kulek magnetycznych A i G białka dla trzech IP.
   11. Umieść próbki na magnesie i poczekaj, aż koraliki się rozdzielą. Podziel chromatynę, przenosząc wcześniej ustaloną ilość do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
   12. Dodaj przeciwciało i owiń nakrętki plastikową folią parafinową, aby uniknąć parowania. Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z obrotem z prędkością 20 obr./min.
       UWAGA: Stężenie należy określić empirycznie zgodnie z zaleceniami producenta.
   13. Następnego dnia wiruj probówki za pomocą mini wirówki w temperaturze pokojowej, 2000 x g, przez 10 s. Następnie dodać 10 μl kulek do każdego IP i inkubować IP przez 3 godziny w temperaturze 4 °C z obrotem z prędkością 20 obr./min.
       
3. IP Mycie i trawienie białek
   1. Dodaj 150 μl buforu RIPA uzupełnionego inhibitorami proteazy o niskim stężeniu (1:1000) do każdego IP i inkubuj IP w temperaturze 4 °C z rotacją przy 20 obr./min przez 5 min. Umieść próbkę na stojaku magnetycznym i pozwól kulkom magnetycznym się rozdzielić. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Powtórz ten krok pięć razy.
   2. Dodać 150 μl buforu chlorku litu (LiCl) (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 % Na-deoksycholanu; przechowywać w temperaturze 4 °C) uzupełnionego inhibitorami proteazy w niskim stężeniu (1:1000) do każdego IP i inkubować IP w temperaturze 4 °C z rotacją przy 20 obr./min przez 5 min. Umieść próbkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż kulki magnetyczne się rozdzielą. Użyć pipety, aby usunąć supernatant.
   3. Dodać 150 μl zimnego Tris-EDTA (TE) (bez inhibitorów proteazy) i inkubować próbkę w temperaturze 4 °C z rotacją przy 20 obr./min przez 5 min. Umieść próbkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż kulki magnetyczne się rozdzielą. Użyć pipety, aby usunąć supernatant.
   4. Po ostatnim etapie przemywania ponownie zawiesić próbkę w 100 μl buforu TE uzupełnionego proteinazą K (0,5 mg/ml) i inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 1 h.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, chłodniczy<	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Lucyferin, sól potasowa<	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A koraliki magnetyczne
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	protein G magnetic beads
EGF	AF-100-15	przygotuj 20 μg/mL bulionu w 0,1% BSA i podwielokrotności.
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma	buffer reagent
Ethyle glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'--kwas tetraoctowy) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Płodowa surowica bydlęca	Gibco	10437028	for freezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	Przygotuj 20 μg/ml bulionu w 0,1% BSA i podwielokrotności.
Kleszcze	Fine Science Tools	11008-13	for dissection of tumor
Glycerol, MB Grade	EMD- Millipore	356352
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	znieczulenie wziewne
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell detachment media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Mikroprobówki o niskim wiązaniu	Corning Costar	CLS3207	low probówka do mikrowirówki wiążącej białka
Probówka do mikrowirówek	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y		N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	środek przeciwbakteryjny, stosować w dawce 0,1 mg/ml.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Koktajl inhibitora proteazy	Sigma-Aldrich	P8340<
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	przygotować 10 mg/ml zapasu w wodzie; podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	zestaw do oczyszczania DNA
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	for dissection of tumor
Chlorek sodu	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Sodium Dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethenee glycol octylphenyl ether
Standardowa mini wirówka	fisherbrand	12-006-901	standardowa mini wirówka
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	fluorescencyjny mikroskop preparacyjny
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>ND-ONEC-W

td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Fisher Scientifictd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Goldbiotd style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>aliquot i przechowywać w temperaturze -20 °C.