Wykonywanie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji genów w skrawkach mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Jolly, S., et.al. Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w sekcjach mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji in situ z podwójną fluorescencją do wizualizacji ekspresji dwóch celów RNA w sekcjach mózgu myszy. Protokół obejmuje sekwencyjne wykrywanie RNA za pomocą sond znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny i digoksygeniną, a następnie enzymatyczne wzmacnianie sygnału w celu zwiększenia czułości. Uzyskana fluorescencja umożliwia analizę kolokalizacji docelowych RNA w tkance.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Hybrydyzacja

1. Przygotuj bufor do płukania o temperaturze 65 °C: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x solankowy cytrynian sodu), 50% (v/v) formamid i 0,1% (v/v) Tween-20.
2. Przygotować bufor MABT: 100 mM kwas maleinowy, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20, pH 7,5.
3. Rozcieńczyć dwie sondy (znakowane DIG i FITC) 1/1,000 w buforze hybrydyzacyjnym (woda dejonizowana uzdatniona DEPC z 50% (v/v) dejonizowanym formamidem, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH₂PO₄, 5 mM Na₂HPO₄, 0,01 mg/ml tRNA drożdży, 1× roztwór Denhardta i 10% w/v siarczanu dekstranu) wstępnie podgrzane do 65 °C i dobrze wymieszać.
4. Na każde szkiełko nanieść około 300 μl mieszaniny hybrydyzacyjnej, nakryć szkiełkiem nakrywkowym z nakrywkami wypieczonymi w piekarniku (200 °C) i inkubować O/N w temperaturze 65 °C w wilgotnej komorze.
5. Przenieś szkiełka do słoika Coplin zawierającego wstępnie podgrzany bufor do mycia. Myć szkiełka przez 30 minut dwa razy w temperaturze 65 °C z buforem do płukania.
6. Umyj szkiełka przez 10 minut trzykrotnie za pomocą MABT w RT.

2. Wizualizacja sondy FITC

1. Przygotuj bufor blokujący ISH: MABT z 2% odczynnikiem blokującym i 10% inaktywowaną termicznie surowicą owczą.
2. Opcjonalnie: za pomocą pisaka hydrofobowego narysuj kółka wokół odcinków tkanki na szkiełku, aby zmniejszyć wymaganą objętość roztworów przeciwciał.
3. Inkubować szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z buforem blokującym ISH w wilgotnej komorze.
4. Inkubować szkiełka O/N w temperaturze 4 °C z przeciwciałem anty-FITC sprzężonym z peroksydazą chrzanową (POD) rozcieńczonym w stosunku 1/500 (v/v) w buforze blokującym ISH.
5. Umieść szkiełka w słoiku Coplin zawierającym PBS z 0,1% (v/v) Tween-20 (PBST). Umyj 3 razy przez 10 minut w PBST i za każdym razem zastąp świeżym PBST.
6. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować tyramid fluorescencyjny, rozcieńczając go 100 razy w rozcieńczalniku Amplifikacja. W tym przykładzie użyj FITC-tyramide.
7. Dodaj to do szkiełek i pozostaw na 10 minut w RT.
8. Umieść szkiełka w słoiku Coplin i myj 3 razy w PBST przez 10 minut.

3. Wizualizacja sondy DIG

1. Przygotuj 0,1 M Tris- HCl pH 8,2.
2. Inkubować szkiełka z buforem blokującym ISH przez 1 godzinę w temperaturze RT.
3. Inkubować szkiełka O/N w temperaturze 4 °C z przeciwciałem anty-DIG sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (AP) rozcieńczonym 1/1,500 (v/v) w buforze blokującym ISH.
4. Myć MABT przez 10 minut trzy razy.
5. Przemyć dwukrotnie 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 przez 5 minut w temperaturze RT.
6. Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór Fast Red, rozpuszczając tabletki w 0,1 M Tris pH 8,2. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μM.
7. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C z roztworem Fast Red w wilgotnej komorze. Ponieważ czas optymalnego rozwoju jest różny, należy regularnie sprawdzać szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby monitorować tworzenie się osadu. W tym przykładzie zatrzymaj reakcję po 2 - 3 godzinach.
8. Umyj PBST przez 10 minut trzy razy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Cytrynian sodu	Sigma	S4641	dla bufora do prania 65°C
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503		Tween-20
Sigma-Aldrich	P1379
Szkiełka nakrywkowe	VWR International	631-0146
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
odczynnik blokujący	11096176001
Aktywowana termicznie surowica owcza	Sigma	S2263
Pióro hydrofobowe	Cosmo Bio	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-przeciwciało sprzężone	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00<
Roche	11093274910
Szybkie czerwone tablety	Roche	11496549001
Średnie	Dako	S3023
Mikroskop konfokalny Leica SP2	Leica
.22 μM filter	Millex	SLGP033RS
Dejonizized formamid	Sigma	F9037	dla bufora blokującego ISH
Chlorek sodu	Sigma	S3014
solny	VWR International	20252.29
Fosforan sodu monobasic bezwodny	Sigma	S8282
Dwuzasadowy dwuwodny fosforan sodu	Sigma	30435
Drożdże tRNA	Roche	10109495001
50x Rozwiązanie Denhardta	Life Technologies	750018
Siarczan dekstranu	D8906
octan sodu	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503

< td style='styl obramowania-po lewej:brak;styl górnej krawędzi:brak;szerokość:135pt;'>Rochetd style='border-top-style:none;height:15.75pt;width:221pt;'>α-DIG AP-sprzężony< td style='styl obramowania po lewej:brak;styl górnej krawędzi:brak;'>Sigma