Barwienie immunofluorescencyjne chorej tkanki włóknisto-naczyniowej pochodzącej od pacjenta z żelem

Streszczenie

Źródło: Gucciardo, E., et. al., model hodowli tkankowej ex vivo dla powikłań włóknisto-naczyniowych w proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film szczegółowo opisuje protokół barwienia immunologicznego dla hodowli ex vivo tkanki włóknisto-naczyniowej osadzonej w żelu fibryny. Umożliwia to szczegółową wizualizację zmian naczyniowych związanych z proliferacyjną retinopatią cukrzycową

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Barwienie immunofluorescencyjne całej góry

UWAGA: Ten protokół trwa 5 dni i może zostać przerwany inkubacjami przez noc, jeśli jest to wskazane. W żadnym momencie nie pozwól, aby żele fibrynowe wyschły. Wszystkie kroki są wykonywane w RT, chyba że wskazano inaczej.

1. Przygotuj następujące roztwory przed rozpoczęciem protokołu barwienia.
   1. Roztwór po utrwaleniu: przygotować roztwór acetonu: metanolu w proporcji 50:50, mieszając równe ilości acetonu i metanolu (e.g., 50 ml). Przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwór należy przygotować najpóźniej w dniu poprzedzającym barwienie. Roztwór ten można przechowywać z powrotem w temperaturze -20 °C i stosować do kolejnych barwień.
      UWAGA: Przygotuj ten roztwór w dygestorium, ponieważ aceton i metanol są łatwopalne i niebezpieczne dla zdrowia.
   2. Roztwór blokujący: przygotować 15% roztwór etoksylanu oktylofenolu bydlęcego (FBS), 0,3% oktylofenolu w PBS, dodając najpierw 15% FBS do PBS. Dodaj etoksylowany oktylofenol i wymieszaj do rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Roztwór ten można przygotować w dużych ilościach z wyprzedzeniem, przechowywać w podwielokrotnościach 15 ml w temperaturze -20 °C i rozmrozić przed użyciem w dniu rozpoczęcia protokołu barwienia. Do każdego protokołu barwienia należy używać świeżo przygotowanych lub świeżo rozmrożonych porcji.
   3. Roztwór myjący: Przygotować 1 l PBS uzupełniony 0,45% etoksylatem oktylofenolu, dodając 4,5 ml etoksylatu oktylofenolu do 995,5 ml PBS. Mieszaj do rozpuszczenia. Przechowywać w RT.
2. Ostrożnie podnieś kropelki z płytki za pomocą szpatułki o kwadratowych krawędziach ze stali nierdzewnej. Odłącz kroplę najpierw od krawędzi przed podniesieniem środka i przenieś do dołka z 12-dołkową płytką zawierającą 1 ml PBS.
   UWAGA: Wykonaj etapy po utrwaleniu, myciu i blokowaniu w tym formacie płyty.
3. Po utrwaleniu kropelek 1 ml lodowatego roztworu acetonu: metanolu w proporcji 50:50 przez ~ 1 minutę (granica kropel zmieni kolor na biały).
   UWAGA: Wykonaj ten krok w dygestorium, ponieważ aceton i metanol są niebezpieczne dla zdrowia.
4. Spłucz 3 - 5 praniami w 2 ml PBS (kropelki zanurzą się w roztworze PBS po zakończeniu nawodnienia).
   UWAGA: Unikaj dotykania kropelek końcówką pipety, ponieważ po utrwaleniu są one lepkie do plastiku. W całym protokole należy unikać zasysania roztworów po utrwaleniu, przeciwciał, roztworów blokujących i myjących przez odsysanie, ponieważ może to uszkodzić lub całkowicie zniszczyć kropelki. Zamiast tego przechyl płytkę i ostrożnie usuń roztwory za pomocą pipety o pojemności 500-5 000 μl.
5. Odwirować roztwór blokujący przez 15 minut w temperaturze 21 000 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń.
   UWAGA: Roztwór można podać w probówkach o pojemności 1,5 ml do odwirowania. Niewykorzystany roztwór może być przechowywany w temperaturze 4 °C i wykorzystywany do wszystkich istotnych dalszych etapów.
6. Inkubować kropelki w 500 μl roztworu blokującego przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Aby zmniejszyć objętość użytego roztworu blokującego, płytkę można przechylić na podporze i użyć zaledwie 300 μl roztworu/kropli.
7. Przygotować mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych (co najmniej 30 μl/kropelkę) w odpowiednim rozcieńczeniu w roztworze blokującym i odwirować przez 15 minut w temperaturze 21 000 x g i temperaturze 4 °C.
8. Przenieść kropelki na okrągłą (U)-dolną płytkę 96-dołkową za pomocą szpatułki o zaokrąglonych krawędziach i inkubować z co najmniej 30 μl/kroplę mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C.{{TAG_ 99}}
9. Następnego dnia przenieś kropelki do 12-dołkowej płytki zawierającej 2 ml roztworu myjącego/studzienki, spłucz najpierw trzema 5-minutowymi płukaniami, a następnie dziewięcioma 30-minutowymi płukaniami. Pozostaw ostatnie płukanie (2 ml) na noc w temperaturze 4 °C.
10. Następnego dnia spłukać trzykrotnie PBS i przenieść kropelki do okrągłej (U) płytki 96-dołkowej z dnem (U).
11. Podczas płukania przygotować odpowiednią mieszaninę przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluoroforem (rozcieńczoną w stosunku 1:500, co najmniej 30 μl/kroplę) w roztworze blokującym i odwirować przez 15 minut przy 21 000 x g i temperaturze 4 °C.
12. Przenieść kropelki do okrągłej płytki 96-dołkowej z dnem (U) za pomocą szpatułki o zaokrąglonych krawędziach i inkubować z co najmniej 30 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych, przez 4 godziny w RT, chroniony przed światłem.
    UWAGA: Wszystkie kolejne etapy inkubacji i mycia należy wykonywać w sposób chroniony przed światłem.
13. Przenieść kropelki do 12-dołkowej płytki zawierającej 2 ml roztworu myjącego/studzienki za pomocą szpatułki o zaokrąglonych krawędziach, spłukać najpierw trzema 5-minutowymi płukaniami, a następnie czterema 30-minutowymi płukaniami. Pozostaw ostatnie pranie (2 mL) na noc w temperaturze 4 °C.
14. Następnego dnia spłucz żele pięcioma 30-minutowymi myciami, a następnie trzykrotnie PBS. Pozostaw ostatnie płukanie (2 ml) na noc w temperaturze 4 °C.
15. Następnego dnia przenieść kropelki na okrągłą (U)-dolną 96-dołkową płytkę za pomocą szpatułki o zaokrąglonych krawędziach i przeciwbarwiących jąder przez inkubację z 10 μg/ml barwnika jądrowego Hoechst (co najmniej 30 μl/kropelkę) przez 30 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować podłoże montażowe uzupełnione 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) do barwienia przeciwstawnego jąder. W takim przypadku ten krok i krok 1.16 są pomijane, przechodząc bezpośrednio do kroku 1.17.
16. Przenieść kropelki do 12-dołkowej płytki zawierającej 2 ml PBS/studzienkę za pomocą szpatułki o zaokrąglonych krawędziach i spłukać trzykrotnie PBS.
17. Zamontuj kropelki na szkiełku mikroskopowym w następujący sposób:
    1. Nałożyć cienką warstwę szybkoutwardzalnego medium montażowego na krawędzie kwadratowego szkła nakrywkowego o wymiarach 22 mm x 22 mm i pozostawić do wyschnięcia na ~1 minutę. Wykonaj ten krok indywidualnie dla każdej kropli, aby uniknąć nadmiernego stwardnienia medium montażowego.
       UWAGA: Wykonaj ten krok w dygestorium, ponieważ szybkoutwardzalny środek montażowy jest niebezpieczny dla zdrowia.
    2. Wypłukać kroplę, zanurzając ją w studzience 12-dołkowej płytki zawierającej 2 ml wody dejonizowanej i przenieść na szkiełko mikroskopowe za pomocą szpatułki o zaokrąglonych krawędziach. Usuń nadmiar wody za pomocą małego kawałka chłonnego papieru.
    3. Na kroplę nanieść 15 μl nietwardniejącego środka mocującego zapobiegającego blaknięciu.
       UWAGA: Alternatywnie, jeśli nie użyto barwnika jądrowego Hoechsta, można użyć podłoża montażowego zawierającego 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI).
    4. Delikatnie umieść szkło nakrywkowe, tak aby szybkoutwardzalny środek montażowy był skierowany w stronę mikroskopijnego szkiełka, nad kroplą i pozostaw do osadzenia.
       UWAGA: Szybko utwardzające się medium przyklei się do mikroskopijnego szkiełka i utrzyma kroplę na miejscu.
18. Powtórz krok 1.17 dla wszystkich kropel. Zamontuj dwie krople na każdym szkiełku mikroskopowym.
19. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez ~2 godziny i przechowuj w temperaturze 4 °C przez noc. Upewnij się, że prowadnice są ustawione poziomo i chronione przed światłem.
20. Zobrazuj barwione rodzime lub końcowe kultury FT ex vivo za pomocą mikroskopu konfokalnego lub pionowego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w funkcję sekcji optycznej i obiektyw 20x lub 40x. Użyj funkcji kafelków, aby uchwycić większy obszar tkanki na raz.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiał
Płytki do hodowli komórkowych, 96-dołkowe, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Używany do immunofluorescencji
Okrągłe/płaskie szpatułki, stal nierdzewna	VWR	82027-528	Używany do immunofluorescencji całkowitego
Szkiełka nakrywkowe 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Używany do montażu
Szkiełka mikroskopowe	Fisher	Kindler K102	Używany do montażu
Papier chłonny	VWR	115-0202	Służy do montażu
tabletki PBS	Medicago	09-9400-100	Służy do przygotowania 1x PBS
Aceton	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Służy do przygotowania roztworu po utrwaleniu. SZKODLIWE: nosić rękawice i/lub odzież ochronną. Stosować w dygestorium.
Metanol	Sigma-Aldrich	32213	Służy do przygotowania roztworu po utrwaleniu. TOKSYCZNE: nosić rękawice i/lub odzież ochronną. Stosować w dygestorium.
Triton X-100 (etoksylowany oktylofenol	Sigma-Aldrich	T9284	Używany do immunofluorescencji całej góry. SZKODLIWE: nosić rękawice i/lub odzież ochronną.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	Do barwienia przeciwstawnego jąder. SZKODLIWE: nosić rękawice i/lub odzież ochronną oraz ochronę oczu i/lub twarzy.
Średni montaż przeciwblakowy VECTASHIELD	Laboratoria wektorowe	H-1000	Nosić rękawice i/lub odzież ochronną oraz okulary ochronne. Stosować w dygestorium.
Medium do montażu przeciwblaknięcia VECTASHIELD z DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Podłoże montażowe z przeciwbarwieniem jąder. Nosić rękawice i/lub odzież ochronną oraz okulary ochronne. Stosować w dygestorium.
Eukitt Szybkotwardniejący średni montaż	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOKSYCZNY: Nosić rękawice i/lub odzież ochronną oraz okulary ochronne. Stosować w dygestorium.
Rekombinowany ludzki VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ ml końcowe stężenie
Rekombinowany człowiek VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ ml końcowe stężenie
Rekombinowany ludzki TGFβ	Millipore	GF346	1 ng/ ml stężenie
Rekombinowany człowiek bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ ml stężenie
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Używany przy rozcieńczeniu 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Używany przy rozcieńczeniu 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Używany przy rozcieńczeniu 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Używany przy rozcieńczeniu 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Kaspaza rozszczepiona-3 (5A1E)	Sygnalizacja komórkowa	9664	Używany przy rozcieńczeniu 1:200, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Używany przy rozcieńczeniu 1:100, Koza anty Królik Alexa 594 Drugorzędny Ab
GFAP	Dako	Z0334	Używany przy rozcieńczeniu 1:100, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Używany przy rozcieńczeniu 1:1500, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	Systemy badawczo-rozwojowe	AF2089	Używany przy rozcieńczeniu 1:100, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Używany przy rozcieńczeniu 1:100, Koza przeciw Królikowi Alexa 594 Drugorzędny Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Używany przy rozcieńczeniu 1:200, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Używany przy rozcieńczeniu 1:40, Kurczak anty Koza Alexa 594 Drugorzędny Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Używany przy rozcieńczeniu 1:100, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Używany przy rozcieńczeniu 1:400, Cy3 sprzężony
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Używany przy rozcieńczeniu
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Używany przy rozcieńczeniu
Alexa Fluor568 Donkey anty-kozia IgG	Thermo Scientific	A-11057	Używany przy rozcieńczeniu 1:500
Alexa Fluor568 Goat anty-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Używany przy rozcieńczeniu 1:500	Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Sondy molekularne
A-21468	Używany przy rozcieńczeniu 1:500
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze	Mikroskopy				Mikroskop odwróconej epifluorescencji Axiovert 200	Zeiss		Do obrazowania świeżego i zatopionego w fibrynie FT
Pionowy mikroskop epifluorescencyjny AxioImager.Z1 z Apotome	Zeiss		Do obrazowania całego wierzchołka wybarwionego immunologicznie FT

całego wierzchowca) końcowe końcowe 1:500 1:500