Ten film demonstruje wykrywanie mRNA w aksonach cholinergicznych w utrwalonych mysich wycinkach hipokampa przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciałami. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przestrzenną lokalizację znakowanych sondą mRNA i acetylotransferazy choliny w neuronach cholinergicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Barwienie immunologiczne neuronów w wycinkach mózgu myszy po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ
880 wyświetleń
⸱
28 kwietnia 2025
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
- Test FISH, a następnie immunohistochemia z użyciem demaskowania antygenu/RNA wywołanego ciepłem
- Zanim zaczniesz, przygotuj cały wymagany materiał:
- Podgrzej piec do hybrydyzacji do 40 °C i umieść w piekarniku tacę zawierającą wodę destylowaną, aby stworzyć nawilżone środowisko.
- Weź pudełko na slajdy i umieść w nim ręczniki papierowe nasączone wodą destylowaną, aby je nawilżyć. Następnie umieść pudełko na szkiełka w piecu do hybrydyzacji.
- Wyjmij sondy (zarówno ujemne, jak i docelowe) z lodówki i podgrzewaj je w piekarniku hybrydyzacyjnym przez 10 minut. Następnie pozwól sondom ostygnąć w RT.
- Zrównoważ odczynniki amplifikacyjne AMP 1-4 (zawarte w zestawie odczynników do multipleksów fluorescencyjnych) w RT.
- Przygotuj roztwór do pobierania antygenu: 10 mM cytrynian sodu (pH 6), 0,05% Tween 20. Uwaga: Roztwór może być przechowywany w RT w nieskończoność i może być używany do przyszłego barwienia.
- Przygotuj 1x bufor do płukania, rozcieńczając 50x roztwór podstawowy (w zestawie odczynników do fluorescencji multipleksowej) w wodzie wolnej od RNaz lub uzdatnionej DEPC.
UWAGA: 1x bufor do prania może być przechowywany w RT przez 1 miesiąc i może być używany do przyszłego barwienia. 50-krotny bufor do płukania może się wytrącić. Jeśli tak, podgrzej 50x bufor do płukania w temperaturze 40 °C przez 10 minut przed przygotowaniem 1x roztworu.
- Wyjmij szkiełka ze 100% etanolu i susz na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Przygotuj słoik z kopiną zawierający 50 ml roztworu do pobierania antygenu. Zanurz szkiełka w roztworze do pobierania antygenu i gotuj je przez 10 minut w kuchence mikrofalowej.
UWAGA: Alternatywnie umieść szkiełka poziomo w okrągłym szklanym naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 100 ml roztworu do pobierania.- Napełnij zlewkę o pojemności 1 l wodą destylowaną i umieść ją w kuchence mikrofalowej.
UWAGA: Woda będzie "buforować" ciepło podczas wykonywania demaskowania. - Umieść szkiełka w roztworze do pobierania antygenu w kuchence mikrofalowej. Gotuj szkiełka z dużą mocą przez 5 minut. Natychmiast po tym, jak próbki przestaną wrzeć, ciepło ponownie ślizga się z dużą mocą przez dodatkowe 5 minut.
- Schłodź szkiełka w RT.
UWAGA: ETAP KRYTYCZNY: czas gotowania i procedura powinny być określone przez użytkownika, w zależności od charakterystyki mikrofal. Im szybciej rozpocznie się wrzenie, tym większe szanse na odparowanie roztworu. W takim przypadku zaleca się, aby próbki były gotowane przez krótsze okresy czasu, więcej niż dwa razy, aby uzyskać całkowity czas demaskowania wynoszący 10 minut. Wręcz przeciwnie, jeśli ogrzewanie odbywa się przy średniej lub niskiej mocy, demaskowanie można wykonać raz na 10 minut. Jeśli jednak próbki nie gotują się w sposób ciągły przez łącznie około 10 minut, może to spowodować częściowe zdemaskowanie zarówno docelowego RNA, jak i białka, które ma zostać wykryte.
- Napełnij zlewkę o pojemności 1 l wodą destylowaną i umieść ją w kuchence mikrofalowej.
- Umyj szkiełka trzy razy za pomocą 1x PBS.
- Dodaj 2 - 3 krople (~100 μl) sondy dapB do tych wycinków mózgu, które służą do oceny barwienia tła. UWAGA: Zestaw sond dapB jest ukierunkowany na gen bakteryjny i nie powinien rozpoznawać RNA ssaków.
- Dodaj 2 - 3 krople zestawu sondy celowniczej do tych wycinków mózgu, które służą do wykrywania interesującego RNA. UWAGA: w tym przykładzie użyto zestawu sond ukierunkowanych na pozostałości 20 - 1,381 mRNA myszy Atf4.
- Przykryj szkiełka parafilmem, aby uniknąć parowania sondy, umieść je w nawilżonym pudełku na szkiełka w piecu do hybrydyzacji i inkubuj w temperaturze 40 °C przez 2 godziny.
UWAGA: OPCJONALNIE: dodatkowe wycinki mózgu mogą być hybrydyzowane za pomocą zestawu sond skierowanych do myszy Polr2A i używane jako kontrole pozytywne. - Przemyć szkiełka dwukrotnie 1x buforem do płukania przez 2 minuty w temperaturze RT.
- Dodaj 2 - 3 krople odczynnika do amplifikacji AMP 1-FL do każdego wycinka mózgu, przykryj szkiełka parafilmem, umieść je w pudełku na szkiełka i inkubuj w temperaturze 40 °C przez 30 minut w piecu do hybrydyzacji.
- Przemyć szkiełka dwukrotnie 1x buforem do płukania przez 2 minuty w temperaturze RT.
- Dodaj 2 - 3 krople odczynnika do amplifikacji AMP 2-FL do każdego wycinka mózgu, przykryj szkiełka parafilmem, umieść je w pudełku na szkiełka i inkubuj w temperaturze 40 °C przez 15 minut w piecu do hybrydyzacji.
- Przemyć szkiełka dwukrotnie 1x buforem do płukania przez 2 minuty w temperaturze RT.
- Dodaj 2 - 3 krople odczynnika do amplifikacji AMP 3-FL do każdego wycinka mózgu, przykryj szkiełka parafilmem, umieść je w pudełku na szkiełka i inkubuj w temperaturze 40 °C przez 30 minut w piecu do hybrydyzacji.
- Przemyć szkiełka dwukrotnie 1x buforem do przemywania przez 2 minuty w temperaturze RT.
- Dodaj 2 - 3 krople odczynnika do amplifikacji AMP 4-FL do każdego wycinka mózgu, przykryj szkiełka parafilmem, umieść je w pudełku na szkiełka i inkubuj w temperaturze 40 °C przez 15 minut w piecu do hybrydyzacji.
- Umyj szkiełka dwukrotnie 1x buforem do płukania przez 2 minuty w RT i dwa razy za pomocą 1x PBS.
- Dodać 100 - 200 μl (lub objętość wystarczającą do całkowitego pokrycia plasterków) roztworu blokującego zawierającego 3 mg/ml BSA, 100 mM glicyny i 0,25% Triton X-100 w PBS (pH 7,4) do szkiełek, przykryć je parafilmem i inkubować przez 30 minut w temperaturze suchej masy.
- Dodać 100 - 200 μl przeciwciała anty-ChAT rozcieńczonego w roztworze blokującym (1/100) do szkiełek, Przykryj je parafilmem i inkubuj przez 2 dni w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że plasterki mózgu nie wysychają. W razie potrzeby ponownie nałóż roztwór przeciwciała anty-ChAT na wycinki mózgu 24 godziny po inkubacji.
- Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBS przez 5 minut w RT.
- Dodaj 100 - 200 μl odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z Alexą (e.g., Alexa-594 osła anty-koza dla tego konkretnego przykładu) do szkiełek, przykryj parafilmem i inkubuj przez 1 godzinę w RT.
- Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBS przez 5 minut w RT.
- Umyj szkiełka raz wodą destylowaną.
- Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego zawierającego DAPI.
- Wizualizuj wycinki mózgu pod mikroskopem fluorescencyjnym.
- Zanim zaczniesz, przygotuj cały wymagany materiał:
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Niestandardowa sonda celująca w pozostałości 20-1381 myszy Atf4 mRNA (NM_009716) | Zaawansowana diagnostyka komórkowa | - | Sonda |
| Niestandardowa sonda celująca w pozostałości 15-1256 ludzkiego mRNA ATF4 (NM_001675.2) | Zaawansowana diagnostyka komórkowa | - | Sonda |
| Sonda kontroli negatywnej-DapB | Zaawansowana diagnostyka komórkowa | 310043 | Sonda |
| Sonda kontroli pozytywnej-mysz Polr2A (opcjonalnie) | Zaawansowana diagnostyka komórkowa | 312471 | Probe |
| Koziołowe przeciwciało poliklonalne anty-ChAT | Millipore | AB144P | |
| Nośnik montażowy ProLong Gold z DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Zestaw odczynników fluorescencyjnych RNAscope (do wykrywania fluorescencji) | Zaawansowana diagnostyka komórkowa | 320850 | Zestaw do hybrydyzacji in situ |
