Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości receptorów neuroprzekaźników w synapsach siatkówki

Streszczenie

Źródło: Zhang, J., et al. Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia technikę mikroskopii elektronowej do wizualizacji lokalizacji receptora neuroprzekaźnika w synapsach siatkówki. Skrawki siatkówki zawierają komórki zwojowe siatkówki, które wykazują receptory neuroprzekaźników związane z błoną i są znakowane podjednostką B toksyny cholery (CTB). Po znakowaniu markerów przeciwciałami sprzężonymi z nanocząstkami złota i przeciwbarwieniu przekroju metalami ciężkimi, receptory RGC są wizualizowane pod mikroskopem.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Utrwalenie tkanki siatkówki

1. Zbierz następujące materiały i narzędzia: mikroskop preparacyjny, 2 kleszcze z bardzo cienkimi końcówkami, nożyczki, celulozową bibułę filtracyjną, plastikową pipetę i szkiełko mikroskopowe.
2. Znieczulić szczura w zamkniętej komorze za pomocą 2,0 ml halotanu (wziewny środek znieczulający). Określ odpowiednie znieczulenie tymi metodami: brak wycofania tylnej łapy po uszczypnięciu palca lub brak odruchu mrugania. Następnie natychmiast odetnij głowę gilotyną. Usuń oczy nożyczkami do tęczówki i umieść w szklanym naczyniu zawierającym 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) o pH 7,4.
3. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego usuń rogówkę, odcinając przednią część gałki ocznej. Usuń soczewkę i ciało szkliste z wewnętrznej powierzchni siatkówki za pomocą kleszczy.
4. Oderwij twardówkę dwoma kleszkami, aż siatkówka zostanie odizolowana od muszli ocznej.
5. Natychmiast pokrój siatkówkę na paski o grubości 100 - 200 μm za pomocą brzytwy i poddaj utrwaleniu pH.
6. Utrwal paski siatkówki w 4% paraformaldehydzie w 0,1 M PB przy pH 6,0 przez 20 - 30 min, a następnie w 4% paraformaldehydzie plus 0,01% aldehydu glutarowego o pH 10,5 przez 10 - 20 min w temperaturze pokojowej (RT).
7. Po kilku płukaniach w PB z 0,15 mM CaCl₂ (pH 7,4 w 4°C), kriozabezpiecz paski siatkówki glicerolem (60 minut każdy w 10%, 20%, 30%, a następnie przez noc [O/N] w 30%) w 0,1 M PB przed zamianą przez zamrożenie.

2. Zamiana przez zamrożenie

UWAGA: Ta metoda zamrożenia i podstawiania jest modyfikowana w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu. Ważne jest również, aby instrumenty były bardzo zimne (nosić rękawiczki); W przeciwnym razie tkanka może częściowo rozmrozić się po dotknięciu narzędziami. Wszystkie te etapy są wykonywane w komorze automatycznego zamrażania i substytucji (AFS), a instrumenty nigdy nie mogą poruszać się ponad krawędź komory. Podobnie, konieczne jest odpowiednie chłodzenie wszystkich chemikaliów stosowanych w AFS.

1. Zanurz i zamroź paski siatkówki w ciekłym propanu w temperaturze -184°C w mikroskopie elektronowym (EM) przyrządzie do kriokonserwacji (CPC). Za pomocą cienkiej szczotki umieść próbki na małych kawałkach podwójnie przyklejonej taśmy przymocowanej do metalowych króćców, które znajdują się na końcu prętów zanurzających (odetnij dodatkowy bufor za pomocą szczotki).
2. Zanurz pręty w ciekłym propanu i trzymaj je tam przez około 5 sekund, a następnie przenieś do automatycznego przyrządu do zamrażania i substytucji (AFS) za pomocą małej komory transportowej, która jest wypełniona chłodzonym pojemnikiem kriotransferowym ciekłego azotu (LN₂).
3. Po umieszczeniu zamrożonej próbki i narzędzi (kleszczy i skalpela) w AFS, należy schłodzić narzędzia w komorze przez kilka minut przed dotknięciem tkanki lub schłodzić je, umieszczając końcówki narzędzi na kilka sekund w małej komorze transportowej (wypełnionej ciekłym azotem (LN₂ chłodzony pojemnik do kriotransferu)).
4. Po wejściu do AFS, Usuń próbkę i taśmę z kikuta za pomocą cienkiego skalpela. Podczas tych procedur należy również utrzymywać otwarty regulator przepływu azotu gazowego, TF (TF jest opisany jako "regulator dla parownika LN₂").
5. Przed umieszczeniem zamrożonej tkanki w płaskich uchwytach do zatapiania (i.e., przed ustawieniem AFS), wytnij cienkie kółko z przezroczystego arkusza z tworzywa sztucznego i umieść je na dnie uchwytu, aby wyłożyć dno każdej studzienki. Pozwala to na stosunkowo łatwiejsze usuwanie spolimeryzowanych bloków próbki po zakończeniu.
   UWAGA: Wcześniej stosowaliśmy metodę alternatywną do płaskich uchwytów do zatapiania i używaliśmy podwójnych kapsułek Reichert + żelatyna.
6. Użyj następującej automatycznej sekwencji w AFS (używając terminologii instrumentów): T1 = -90°C przez 32 godziny, S1 = wzrost temperatury o 4°C/h (11,3 h), T2 = -45°C przez 50 godzin, S2 = wzrost temperatury o 5°C/h (9 h), T3 = 0°C przez 40 godzin (łącznie = 142,3 h). Umieszczenie próbek w systemie AFS (w temperaturze -90°C) przed rozpoczęciem sekwencji czasowej może zająć od 2 do 4 godzin.
7. Zanurz zamrożone skrawki w 1,5% octanie uranylu w metanolu w temperaturze -90°C na >32 godziny w AFS. Umieść dwa kawałki chusteczek (zazwyczaj) w każdym z siedmiu dołków w aluminiowym uchwycie do płaskiego osadzania (trzy pasują do AFS).
   1. Umieść tkankę + taśmę w octanie uranylu/metanolu w studzienkach i usuń taśmę później, tuż przed rozpoczęciem infiltracji pożywki (takiej jak Lowicryl HM20), jeśli usunięcie tkanki z taśmy jest zbyt trudne.
8. Następnie stopniowo zwiększaj temperaturę do -45°C (+4°C na godzinę; w sekwencji automatycznej).
9. Umyj próbki trzykrotnie we wstępnie schłodzonym metanolu, używając plastikowej pipety z cienką końcówką w celu usunięcia starego roztworu z każdego płaskiego uchwytu do zatapiania, a następnie używając innej standardowej pipety z tworzywa sztucznego, aby dodać wstępnie schłodzony świeży metanol.
10. Następnie, stosując tę samą metodę, stopniowo infiltruj próbki żywicami do zatapiania w niskiej temperaturze, takimi jak medium do zatapiania (HM20 / metanol w stosunku 1:1 i 2:1, każda przez 2 godziny, a następnie czysta żywica przez 2 godziny, a następnie zmień żywice i zachowaj O/N).
11. Następnego dnia ponownie zmień żywicę, dostosowując poziom żywicy tak, aby sięgała tylko do górnej krawędzi studzienek.
12. Polimeryzować próbki (od -45°C do 0°C w sekwencji automatycznej; +5°C na godzinę) światłem ultrafioletowym (UV) przez 40 godzin.
13. Następnie usuń próbki z AFS. Zazwyczaj bloki próbek nadal wykazują pewien różowy kolor. Umieść próbki w pobliżu światła fluorescencyjnego w dygestoriach chemicznych, w temperaturze RT O/N lub dłużej, aż staną się całkowicie przezroczyste.

3. Postembaseding EM Immunocytochemistry

1. Wytnij skrawki 1 μm ultramikrotomem, wybarwij skrawki 1% błękitem toluidynowym i zbadaj je pod kątem orientacji sekcji; Zorientuj blok tkankowy, aby uzyskać optymalną płaszczyznę poprzeczną przekroju.
2. Wytnij ultracienkie sekcje o grubości 70 nm za pomocą ultramikrotomu i zbierz je na niklowych kratkach szczelinowych pokrytych węglem Formvar.
3. Przemyć kratki jeden raz w destylowanym H₂O, a następnie trzykrotnie (TBS, 0,05 M bufor Tris, 0,7% NaCl, pH 7,6) przepłukać.
4. Inkubować siatki w 20 μl kropli 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w TBS przez 30 minut, a następnie w 20 μl kroplach mieszaniny zawierającej podjednostkę B koziej toksyny przeciwcholerycznej (anty-CTB, 1:3 000) i przeciwciało przeciwko jednej podjednostce receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR) (anty-królicza glutaminergiczny podjednostka NMDAR A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30) lub anty-króliczej GluA2/3 (heterotetrametyczny receptor kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazopropionowego [AMPA], 1:30) w TBS-Triton (TBST, 0,01% Triton X-100, pH 7,6) z 2% BSA i 0,02 M NaN₃ O/N w RT.
5. Umyj kratki na trzech oddzielnych kroplach (20 μl) TBS (pH 7,6) przez 10, 10 i 20 minut, a następnie TBS (pH 8,2) przez 5 minut.
6. Inkubuj siatki przez 2 godziny krople (20 μl) mieszaniny zawierającej immunoglobulinę przeciw królikowi G (IgG, 1:20) sprzężoną z cząstkami złota o długości 10 nm i antykoziołkową IgG (1:20) sprzężoną z cząstkami złota o długości 18 nm w TBST (pH 8,2) o 2% BSA i 0,02 M NaN₃.
7. Myj kratki w 20 μl kropli TBS (pH 7,6) przez 5, 5 i 10 minut, a następnie w ultraczystej wodzie, a następnie wysusz.
8. Przeciwbarwić siatki z 5% octanem uranylu i 0,3% cytrynianem ołowiu w destylowanym H₂O odpowiednio przez 8 i 5 minut w ciemnych warunkach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Paraformaldehyd	EMS	15710
Glutardehyd	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Rozcieńczenie 1/50
Anti-GluN2B	Milipore	AB1557P	Rozcieńczenie 1/30
Rozcieńczenie Anti-GluA2/3 Millipore		AB1506	1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Rozcieńczenie 1/100
Cząstki złota przeciw oślim IgG-10 nm	EMS	25704	Rozcieńczenie 1/20
Cząstki złota anty-mysie Ośle EMS		25814	Rozcieńczenie 1/20
Cząsteczki złota IgG-5 nm przeciwko osła.	EMS	25812	Rozcieńczenie 1/20
Cząstki złota przeciw kozom IgG-18 nm Ośli Jackson	ImmunoResearch	705-215-147	Rozcieńczenie 1/20
Siatki niklowe powlekane węglem formvar.	EMS	FCF2010-Ni
Octan uranylu	EMS	22400-1
Metanol	EMS	67-56-1
Cytrynian ołowiu	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
ciekły azot	Roberts Oxygen
Propan	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
Lista anty-CTB	Laboratoria biologiczne	703	Rozcieńczenie 1/4000