Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji receptorów zapachowych w komórkach rekombinowanych

Streszczenie

Źródło: de March, C. A. et. al., Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora odorantu przez nawaniacz w fazie gazowej. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film przedstawia metodę monitorowania aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym w rekombinowanych komórkach ssaków za pomocą pomiaru luminescencji. Wiązanie odorantu wyzwala aktywację białka G i produkcję cAMP, aktywując białka glosensor, które emitują luminescencję po związaniu substratu, zapewniając ilościową miarę odpowiedzi receptora.

Protokół

1. Hana3A Cells Culture

1. Przygotuj M10 (Minimum Essential Medium (MEM) plus 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i M10PSF (M10 plus 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny i 1,25 μg/ml amfoterycyny B).
2. Hoduj komórki w 10 ml M10PSF w 100-milimetrowej naczyniu do hodowli komórkowej w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2).
3. Dziel komórki co 2 dni w stosunku 20%: gdy pod mikroskopem z kontrastem fazowym zaobserwuje się 100% zbieżność komórek (około 1,1 x 10⁷ komórek), zaaspiruj pożywkę i delikatnie umyj komórki 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
4. Odessać PBS i dodać 3 ml 0,05% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 0,48 mM). Pozwól działać przez około 1 minutę, aż komórki oddzielą się od płytki.
5. Dodaj 5 ml M10, aby dezaktywować trypsynę i ostatecznie odłączyć komórki nadal przyczepione do płytki poprzez pipetowanie w górę i w dół.
6. Przenieś objętość (8 ml) do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 200 x g przez 5 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml M10PSF, pipetując w górę i w dół, aby rozbić dowolną masę komórkową. Unikaj tworzenia bąbelków w tubie.
7. Przenieś 1 ml roztworu zawieszonych komórek do nowego naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm i dodaj 9 ml świeżego M10PSF. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

2. Przygotowanie komórek do transfekcji

1. Oceń zbieg, czyli liczbę komórek, obserwując je pod mikroskopem kontrastu fazowego. Na jedną płytkę potrzebna jest co najmniej 10% konfluencja (około 1,1 x 10⁶ komórek).
2. Odessać pożywkę i delikatnie umyć komórki 10 ml PBS. Odessać PBS i dodać 3 ml EDTA. Pozostaw na około 1 minutę w temperaturze pokojowej, aż komórki oddzielą się od płytki.
3. Dodaj 5 ml M10, aby dezaktywować trypsynę i ostatecznie odłączyć komórki nadal przyczepione do płytki, pipetując w górę i w dół. Przenieść objętość (8 ml) do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml M10PSF, pipetując w górę i w dół, aby rozbić dowolną masę komórkową. Unikaj tworzenia bąbelków w tubie.
5. W zależności od liczby płytek do transfekcji, przenieś odpowiednią ilość komórek do zbiornika o odpowiedniej objętości M10PSF. Jedną 96-dołkową płytkę należy posiać 1/10 1/10 100% zlewającej się płytki o średnicy 100 mm (około 1,1 x 10⁶ komórek) rozcieńczonej w M10PSF, aby osiągnąć całkowitą objętość 6 ml. Na jedną 96-dołkową płytkę, zaczynając od 100% zbieżności 100 mm, dodaj 500 μl z 5 ml zawieszonych komórek do 5,5 ml świeżego M10PSF. Wymieszaj ogniwa i M10PSF bez generowania pęcherzyków powietrza.
6. Odpipetować 50 μl zawieszonych komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ .

3. Transfekcja

1. plazmiduObserwuj 96-dołkową płytkę pod mikroskopem kontrastu fazowego, aby upewnić się, że zbieżność komórek wynosi od 30% do 50%.
2. Przygotuj pierwszą mieszankę transfekcyjną, która zawiera plazmidy wspólne dla całej płytki (krótsza wersja białka transportującego receptor 1 (RTP1S), receptora zapachowego (OR) i białka Glosensor; patrz Tabela Materiałów) zgodnie z tomami w Tabeli 1. Zwróć uwagę, że ilość OR oznaczonych Rho powinna być podzielona przez liczbę OR, jeśli jest kilka OR.
   UWAGA: Zdecydowanie zalecamy dodanie do planu eksperymentu kontroli negatywnej pustego wektora (tutaj Rho-pCI) i dowolnej kontroli pozytywnej (LUB znanej z reakcji na badany nawaniacz).
3. Przygotuj drugą mieszankę transfekcyjną zawierającą 500 μL MEM i 20 μL odczynnika Lipofectamine 2000 (ważne dla jednej płytki 96-dołkowej, patrz Tabela Materiałów). Dodaj drugą mieszankę do pierwszej i delikatnie mieszaj, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 5 ml M10 i delikatnie wymieszaj.
4. Zastąp M10PSF w poprzednio platerowanej płytce 96-dołkowej przez 50 μL końcowego podłoża do transfekcji. Inkubować w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO₂ i odkurzać komorę luminometru przez noc.

4. Substrate Incubation

1. Obserwuj 96-dołkową płytkę pod mikroskopem kontrastu fazowego, aby zapewnić zbieżność komórek między 60% a 100%. Przygotować roztwór symulacyjny zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierający 10 mM kwasu hydroksyetylopiperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 5 mM D-glukozy.
2. Rozcieńczyć 75 μL roztworu cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) (patrz Tabela Materiałów) do 2,75 ml roztworu stymulującego. Usunąć pożywkę transfekcyjną z płytki 96-dołkowej i umyć komórki, dodając 50 μl świeżego roztworu stymulacyjnego do każdego dołka.
3. Usuń roztwór stymulujący i dodaj 25 μl roztworu odczynnika cAMP przygotowanego w kroku 4.2 do każdej studzienki. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej w ciemnym i wolnym od zapachów środowisku (na przykład w czystej, pustej szufladzie z dala od chemikaliów lub źródeł nawania) przez 2 godziny.

5. Stymulacja odorantu

1. Najpierw zrównoważ komorę luminometru z lotnymi cząsteczkami odorantu. Rozcieńczyć środek zapachowy do pożądanego stężenia w 10 ml oleju mineralnego (rysunek 1A). Przed końcem czasu inkubacji odczynnika cAMP dodać 25 μl roztworu nawaniacza do nowej płytki 96-dołkowej (nie tej, na której znajdują się komórki). Inkubować tę płytkę nawaniającą w temperaturze pokojowej w komorze luminometru przez 5 minut (rysunek 1B) (w tym przypadku nie jest wymagany zapis luminometrem).
2. Ustaw luminometr tak, aby rejestrował luminescencję z 0 s opóźnienia podczas 20 cykli pomiaru płytki co 90 s z 0,7 s przerwy między cyklami.
3. Tuż przed odczytaniem tabliczki wyjmij płytkę nawaniającą z komory. Dodać 25 μl środka nawaniającego między studzienki 96-dołkowej płytki zawierającej komórki (nie dodawać środka nawaniającego do studzienek zawierających komórki) i szybko rozpocząć pomiar luminescencji wszystkich studzienek przez 20 cykli w ciągu 30 minut (rysunek 1C).

Tabela 1: Mix do transfekcji. Ilości plazmidów (białko Glosensor, RTP1S i OR) do dodania do MEM w celu transfekcji na jedną 96-dołkową płytkę.

	Na płytkę 96-dołkową
MEM	< span style='kolor tła: przezroczysty; kolor:#1a202c;'>500 μL
pGlosensor	10 ng
RTP1S	5 ng
OR	75 ng

 

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne protokoły monitorowania w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez odparowany środek zapachowy. Środek zapachowy (fioletowy) rozcieńczono ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05 % trypsyna-EDTA	Gibco	25300-054	0,05% Trypsyna - EDTA (1x), czerwień fenolowa - przechowywać w temperaturze 4 °C
{{}}100 mm naczynie do hodowli komórkowych	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm naczynie do hodowli komórkowych
15 ml rurka	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm rurki stożkowe
96-dołkowa płyta	Corning	3843	96 dobrze, z pokrywą LE biała z przezroczystym dnem Polistyren pokryty poli-D-lizyną
Amfoterycyna	Gibco{{TAG_ 53}}	15290-018	Amfoterycyna B 250 μg/ml - przechowywać w temperaturze 4 °C
Wirówka	Jouan	C312	Wirówka z wahliwym wirnikiem kubełkowym do 15 mL
Klasa II Typ A/B3 spalin	NUAIRE	NU-407-500	Dymy do hodowli komórkowych
FBS	Gibco	16000-044	Płodowa surowica bydlęca - przechowywać w temperaturze -20 °C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescencyjny substrat białkowy - przechowywać w temperaturze -20 ° C
Inkubator 37 °C; 5 % dwutlenku węgla	Fisher Scientific	11-676-604	Inkubator do hodowli komórek
Odczynnik Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Odczynnik 1mg/ml odczynnik do transfekcji - przechowywać w temperaturze 4 °C{
Luminometr POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	wycofane	96 dołkowy czytnik płytek do luminescencji
Olej mineralny	Sigma	M8410	Rozpuszczalnik do nawaniaczy - przechowywać w temperaturze pokojowej
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle z solami Earle'a i L-glutaminą - przechowywać w temperaturze 4 °C
Penicylina/Streptomycyna	Sigma Aldrich	P4333	Roztwór penicyliny-streptomycyny stabilizowany 10 000 U penicyliny i 10 mg streptomycyny - przechowywać w temperaturze -20 ° C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F plazmid białka luminescencyjnego cAMP - przechowywać w temperaturze 4 °C
Mikroskop z kontrastem fazowym	Leica	090-131.001	Mikroskop z kontrastem fazowym z x4, x10, x20 cele
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/μL plazmid - przechowywać w temperaturze 4°C