$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Znieczulenie do przygotowania kory mózgowej
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej z 2-3% izofluoranem zmieszanym z tlenem w celu wywołania znieczulenia. Obserwuj spadek częstości oddechów w miarę indukcji myszy. Uszczypnij łapę myszy, aby określić, czy mysz jest gotowa do przejścia do stożka nosowego. Uwaga: Poziom znieczulenia jest krytycznym krokiem w każdym przygotowaniu in vivo i należy zachować ostrożność, aby nie wywołać poziomu, który spowoduje globalne niedokrwienie.
- Gdy mysz jest wystarczająco znieczulona, przenieś zwierzę na platformę chirurgiczną/obrazową i umieść nos myszy w stożku nosowym i zastosuj 1-1,2% izofluoranu, aby utrzymać stan znieczulenia. Upewnij się, że mysz leży na poduszce grzewczej o kontrolowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę ciała (37°C +/- 0.5°C) podczas pozostałych procedur. Umieść maść weterynaryjną na oczach, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
- Monitoruj fizjologię myszy za pomocą systemu pulsoksymetrii za pomocą klipsa ogonowego lub stopowego dostarczonego z systemem. Sprawdź, czy częstość oddechów utrzymuje się w zakresie 50-65 oddechów/min. Sprawdź, czy tętno utrzymuje się w zakresie od 300 do 450 uderzeń na minutę, a nasycenie tlenem utrzymuje się w zakresie 97-98%, aby zapewnić długotrwałe przeżycie zwierzęcia.
- Gdy mysz jest odpowiednio znieczulona, ogol włosy nad czaszką za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia, usuń resztki włosów i wyczyść betadyną, a następnie wacikiem etanolowym. Powtórz tę procedurę do trzech razy, aby zapewnić sterylne środowisko chirurgiczne.
2. Zabieg chirurgiczny
- Gdy skóra głowy jest całkowicie oczyszczona i ogolona, wykonaj 5-milimetrowe nacięcie w skórze głowy myszy, aby odsłonić szczeliny czaszki i zlokalizować bregmę.
- Użyj sterylnego bawełnianego aplikatora, aby usunąć pozostałą powięź pokrywającą czaszkę.
- Przyklej wykonany na zamówienie pierścień ze stali nierdzewnej (Rysunek 1) z klejem tkankowym do kości leżącej nad korą ciemieniową, używając współrzędnych stereotaktycznych Bregmy: od -1 do -3 mm i bocznych: 2-4 mm. Uwaga: Klej zwykle twardnieje w ciągu 2 minut po umieszczeniu pierścienia na kości.
- Przymocuj pierścień do uchwytu stereotaktycznego (Rysunek 2), aby ustabilizować mysz i zapobiec ruchowi podczas obrazowania.
- Pod mikroskopem preparacyjnym klasy chirurgicznej powoli wywierć odcinek 1-2 mm w czaszce za pomocą narzędzia podobnego do dremelu o regulowanej prędkości (wiertło Meisinger 3,9 mm), upewniając się, że obszar jest równy podczas wiercenia. Osiągnij to za pomocą zygzakowatego wzoru. Aby uniknąć gromadzenia się ciepła, ustaw niską prędkość wiertła i rób częste przerwy.
- Kiedy czaszka czaszki stanie się błyszcząca, kontynuuj przerzedzanie czaszki za pomocą ostrza skalpela, wykorzystując ten sam zygzakowaty wzór, aby utrzymać ścieńszoną powierzchnię na poziomie i ułatwić płynne usuwanie cienkich warstw czaszki. Za pomocą końcówki ostrza skalpela wykonuj małe liniowe pociągnięcia z lekkim naciskiem, aby usunąć cienkie warstwy kości na raz. Kontynuuj, aż układ naczyniowy będzie wyraźnie widoczny pod mikroskopem preparacyjnym.
- Jeśli eksperymentator przebije lub złamie czaszkę podczas procesu przerzedzania, zwierzę zostanie poddane eutanazji z powodu prawdopodobnego uszkodzenia kory mózgowej.
Uwaga: Czaszka myszy ma około 300 μm grubości i składa się z dwóch cienkich warstw zwartej kości (jedna zewnętrzna i jedna wewnętrzna) oraz warstwy gąbczastej kości umieszczonej pomiędzy dwiema warstwami zwartej kości. Zewnętrzna warstwa zwartej kości i większość kości gąbczastej są usuwane w obszarze wiercenia o średnicy 5 mm, co powoduje, że pozostaje około 50 μm warstwy zwartej kości (patrz Rysunek 2B). Wizualizacja układu naczyniowego zapewni, że ostateczna nienaruszona, przerzedzona czaszka ma grubość około 50 μm. Czaszka jest zatem nadal obecna, gdy zostanie przerzedzona do tej grubości.
3. Konfiguracja mikroskopu
- Użyj systemu mikroskopu odwróconego (konwencjonalny, konfokalny lub dwufotonowy), który ma falownik obiektywu. Uwaga: Możliwe jest również użycie standardowego mikroskopu pionowego. Czynnikiem ograniczającym będzie przestrzeń między sceną a celami. Do wykonania tej konfiguracji mogą być konieczne modyfikacje sceny.
- Przymocuj platformę chirurgiczną/obrazową do specjalnie zaprojektowanego stolika, który znajduje się obok podstawy mikroskopu. Uwaga: Platforma jest wykonana za pomocą podnośnika laboratoryjnego, aby umożliwić pionowy ruch platformy chirurgicznej/obrazowej pod obiektywem. Podnośnik laboratoryjny jest zamontowany na płycie przymocowanej do czterech cylindrycznych biegunów. (Patrz Rysunek 2).
- Umieść falownik obiektywu zawierający obiektyw 20X nad oknem czaszki. Użyj zewnętrznego źródła światła, aby znaleźć okno czaszki, patrząc przez okulary mikroskopu i ustaw obiektyw w obszarze obrazowania. Uwaga: Obszar obrazowania będzie oznaczony obecnością układu naczyniowego.
- Do celów opartych na wodzie należy użyć sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH2PO4; 200 mM NaHCO3; 30 mM hydroksyetylopiperazyny, etanu sulfonu [HEPES]; i 100 mM glukozy) jako medium ze względu na potencjalny wyciek do jamy czaszki podczas obrazowania (Rysunek 3).
4. Przygotowanie barwnika różanego bengalskiego, podawanie i indukcja udaru
- Przygotuj świeży roztwór 20 mg/ml róży bengalskiej w CSF; Przefiltrować i wysterylizować przed podaniem. Nie używaj ponownie ani nie przechowuj Rose Bengal po wymieszaniu. Przygotuj nowe rozwiązanie dla każdego eksperymentu.
- Wykonaj 0,1 ml wstrzyknięcia do żyły ogonowej Rose Bengal, skanując okno czaszki laserem o długości fali 561 nm, aby zapewnić odpowiednie wstrzyknięcie roztworu. Uwaga: Róża bengalska zostanie uwidoczniona w ciągu 5 sekund po wstrzyknięciu do układu naczyniowego mózgu. Całe naczynie powinno być wypełnione Rose Bengal.
- Po odpowiednim wstrzyknięciu barwnika Rose Bengal należy wybrać odpowiednie naczynie do zakrzepicy na podstawie średnicy naczynia (40-80 μm), aby zapewnić powtarzalność określonej objętości zmiany. Rozróżnij tętnice i żyły, patrząc na kierunek przepływu krwi: tętnice będą się przemieszczać z naczyń o większej średnicy do naczyń o mniejszej średnicy, żyły przemieszczają się z naczyń o mniejszej do większej średnicy. Można to łatwo osiągnąć poprzez wizualizację po wstrzyknięciu Rose Bengal.
- Zmień ustawienie mikroskopu w następujący sposób:
- Zwiększ czas przebywania. Uwaga: Będzie się to różnić w zależności od używanego systemu mikroskopu.
- Zwiększ moc lasera do 100%.
- Zbieraj obrazy sekwencji czasowej z prędkością 1 klatki/s, korzystając z maksymalnej prędkości skanowania.
- Skanuj mysz, aż w naczyniu utworzy się stabilny skrzep. Uwaga: Zazwyczaj osiąga się to w ciągu 5 minut ciągłego skanowania (patrz Rysunek 4).
- Po indukcji tworzenia się skrzepów za pomocą Rose Bengal, usuń mysz z obszaru obrazowania z powrotem do mikroskopu preparacyjnego. Ostrożnie zdejmij pierścień ze stali nierdzewnej z czaszki. Zbadaj okno czaszki pod kątem krwawienia. Jeśli wystąpi krwawienie, przerwij eksperyment.
- Użyj szwu monofilamentowego 6.0, aby zamknąć nacięcie nad czaszką. Umieść maść z antybiotykiem wzdłuż linii szwów, aby zapobiec infekcji. Wstrzykiwać Buprenex (0,05 mg/kg) podskórnie co 12 godzin przez trzy dni w celu leczenia bólu.
- Po wyjęciu ze środka znieczulającego umieść mysz w komorze regeneracyjnej, aż do momentu, gdy zostanie całkowicie wybudzona i będzie się swobodnie poruszać.
- Przywróć mysz do czystej klatki w celu dalszego zbadania w późniejszym czasie.
