Ocena integralności bariery krew-mózg w szczurzym modelu uszkodzenia mózgu wywołanego laserem

Streszczenie

Źródło: Kuts, R. et al. Wywołane laserem uszkodzenie mózgu w korze ruchowej szczurów. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film przedstawia ocenę integralności bariery krew-mózg (BBB) po uszkodzeniu mózgu wywołanym laserem u szczurów. Barwnik śledzący jest wstrzykiwany do żyły ogonowej, umożliwiając mu krążenie do mózgu i wyciek do tkanki przez uszkodzoną barierę krew-mózg. Mózg jest następnie ekstrahowany i przetwarzany w celu uwolnienia barwnika. Intensywność fluorescencji barwnika jest mierzona w celu ilościowego określenia zakresu uszkodzenia BBB wywołanego laserem.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Procedura eksperymentalna uszkodzenia mózgu wywołanego laserem

1. Przypisz 20 szczurów do grupy oznaczonej jako grupa laserowa i 20 szczurów do innej grupy kontrolnej (pozorowana).
2. Poddaj szczury grupy laserowej napromieniowaniu laserowemu w 50J X 10 punktów w następujący sposób:
   1. Znieczulij szczura mieszaniną 2% izofluranu w tlenie, co pozwala na spontaniczną wentylację. Sprawdź, czy głębokość znieczulenia jest wystarczająca, ściskając ogon kleszczami, aby zobaczyć brak odruchu wycofania.
   2. Utrzymuj temperaturę ciała szczura na poziomie 37 °C przez cały czas trwania procedury doświadczalnej za pomocą poduszki grzewczej o regulowanej temperaturze doodbytu.
   3. Usuń miejscowe włosy za pomocą golarki i zdezynfekuj 70% alkoholem i 0,5% glukonianem chlorheksydyny. Powtórz krok dezynfekcji jeszcze dwa razy.
      UWAGA: Rozmiar nacięcia chirurgicznego powinien wynosić około 3 cm. Usuń włosy co najmniej 2 cm wokół obszaru nacięcia.
   4. Umieść szczura na stereotaktycznym uchwycie głowy w pozycji leżącej i wykonaj 3 cm nacięcie, aby odbić bocznie skórę głowy i odsłonić obszar między Bregmą a Lambdą.
   5. Utrzymuj znieczulenie przez stożek nosowy.
   6. Użyj lasera z granatem itrowo-aluminiowym domieszkowanym neodymem (Nd-YAG) (szczytowa długość fali 1064 nm), aby podać 50J X 10 punktów, o czasie trwania impulsu 1 s, do odsłoniętego obszaru czaszki powyżej prawej półkuli.
   7. Upewnij się, że część urządzenia generująca laser znajduje się w odległości 2 mm od odsłoniętego obszaru, aby wytworzyć wiązkę laserową. 50J X 10 punktów zostało wybranych po dokładnej ocenie różnych kombinacji energii/powierzchni. Ta kombinacja jest skuteczna i nie powoduje zniszczenia kości czaszki po podaniu przez mniej niż sekundę.
      UWAGA: 2 mm to odległość między końcem wiązki laserowej (od kabla optycznego, przez który jest przepuszczana) a kością czaszki. W przypadku zastosowania soczewki skupiającej, odległość należy obliczyć z uwzględnieniem kąta nachylenia soczewki, aby skupić wiązkę w żądanym obszarze uszkodzenia. Zapewnij odpowiednie bezpieczeństwo podczas korzystania z urządzenia laserowego, w tym odpowiednie szkolenie i ochronę oczu.
   8. Wyjmij szczura z urządzenia i zamknij skórę głowy jedwabnymi szwami chirurgicznymi 3-0.
   9. Przerwij znieczulenie i wróć szczura do klatki w celu wyzdrowienia. Podawać miejscowo 0,1 ml 0,25% bupiwakainy w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego bezpośrednio po zabiegu.
      UWAGA: Cała procedura powinna trwać krócej niż 5 minut, jeśli zostanie wykonana poprawnie.
3. Obserwuj szczura pod kątem oznak niepokoju podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Przed wyjściem ze znieczulenia podaj domięśniowo 0,01 mg/kg buprenorfiny w celu znieczulenia pooperacyjnego i kontynuuj powtarzanie dawek co 12 godzin przez co najmniej 48 godzin.
4. Poddaj szczury kontrolne tym samym warunkom bez poddawania ich działaniu lasera.

2. Ocena ciężkości neurologicznej (NSS)

1. Oceń wynik ciężkości neurologicznej 24 godziny po uszkodzeniu mózgu wywołanym laserem, korzystając z 43-punktowego wyniku. Przetestuj zwierzęta pod kątem deficytów neurologicznych, zaburzeń zachowania, zadania równoważenia wiązki i odruchów, przypisując wyższe wyniki poważniejszym niepełnosprawnościom.

3. Ocena uszkodzenia mózgu

1. }Określanie stopnia uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB)
   UWAGA: Oceń pęknięcie BBB 24 godziny po indukowanym laserem uszkodzeniu mózgu w następujący sposób:
   1. Podaj szczurom dożylnie 2% Evans Blue zmieszany z 4 ml / kg roztworu soli fizjologicznej przez kaniulowaną żyłę ogonową i pozwól roztworowi krążyć przez 1 godzinę.
   2. Poddaj szczury eutanazji, wystawiając je na działanie 20% tlenu i 80% CO₂ (przez wdech) 24 godziny po ostatnim NSS.
   3. Zbierz barwnik zlokalizowany wewnątrznaczyniowo w następujący sposób:
      1. Otwórz klatki piersiowe szczurów za pomocą pincet chirurgicznych i nożyczek chirurgicznych.
      2. Perfuzję zwierząt ze schłodzoną 0,9% solą fizjologiczną przez lewą komorę przy użyciu 110 mmHg aż do uzyskania bezbarwnej cieczy perfuzyjnej z prawego przedsionka.
   4. Zbierz mózgi i pokrój je doogonowo na plastry o średnicy 2 mm.
   5. Oddziel lewe wycinki mózgu od prawych części, aby osobno ocenić uszkodzone i nieuszkodzone półkule.
   6. Zważyć, homogenizować za pomocą moździerza i tłuczka, a następnie inkubować tkanki mózgowe w 50% kwasie trójchlorooctowym przez 24 godziny.
   7. Odwiruj homogenizowane wycinki mózgu w temperaturze 10 000 × g przez 20 minut.
   8. Wymieszaj 1 ml supernatantu z odwirowanego mózgu z 1,5 ml 96% etanolu w stosunku 1:3 i oceń barierę krew-mózg Uszkodzenie za pomocą detektora fluorescencji przy długości fali wzbudzenia 620 nm (szerokość pasma 10 nm) i długości fali emisji 680 nm (szerokość pasma 10 nm).
      UWAGA: Obie grupy szczurów przechodzą ten sam protokół określania rozkładu BBB.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
50% kwas trichlorooctowy	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Matryce mózgowe i tkankowe	SIGMA - ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.84E+11
Wirówka Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Kompaktowe wagi analityczne	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Cyfrowa waga	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Nożyczki do preparowania	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Pipeta Eppendorf	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Rurka Eppendorf	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Etanol 96 %	ROMICAL		Ciecz
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Detektor fluorescencji	Tecan, Männedorf Szwajcaria	model Czytnik wielomodowy
Grzałka z termometrem	Heatpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Mankiet infuzyjny	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL 998702
Mikroskop Olympus BX 40	Olympus
szalki Petriego	SIGMA - ALDRICH	P5606
Ostrza skalpela 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Maszyna laserowa Sharplan 3000 Nd:YAG (granat itrowo-aluminiowy domieszkowany neodymem)	Laser Industries Ltd
Stereotaktyczny uchwyt głowicy	KOPF	900LS
Sterylna strzykawka 2 ml	Braun	4606027V
igła strzykawkowa 27 G	Braun	305620

łatwopalnaInfinite 200 PRO