Lokalizacja fluorescencyjna białek połączeń ścisłych i włókien stresowych w komórkach śródbłonka

Streszczenie

Źródło: Alluri, H., et al. Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg. J. Vis. Exp. (2015).

Film pokazuje fluorescencyjną lokalizację białek połączeń ścisłych i włókien stresowych w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu szczura (RBMEC). W zestresowanej monowarstwie przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są używane do znakowania białek połączeń ścisłych, podczas gdy znakowana fluoroforem falloidyna znakuje włókna stresowe. Znakowane cząsteczki są następnie wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Protokół

1. Wysiewanie komórek śródbłonka

1. UWAGA:²NOTE:2. Deprywacja-reoksygenacja tlenu i glukozy (OGD-R) In vitro Model
   1. Użyj systemu hodowli komórek hipoksji, aby zbadać wpływ OGD-R na RBMEC w (patrz Rysunek 1). Skonfiguruj i skalibruj system hodowli komórek hipoksji przed rozpoczęciem eksperymentu, zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. ₂ and 5% CO₂ przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, aby reprezentować stan OGD.
   3. ₂, 5% CO₂UWAGA:<span style='rodzina czcionek:Arial,bezszeryfowy;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Ten krok reprezentuje sytuację ponownego natlenienia.
   4. 3. Immunofluorescencja Lokalizacja zonula occludens-1 (ZO-1) i nitkowatej aktyny (f-aktyna) Etykietowanie za pomocą Rhodaminy Phalloidyny
      1. Wystaw szkiełka komory zawierające monowarstwy RBMEC na 100 μl opti-MEM/zredukowanej pożywki surowicy/studzienki przez 1 godzinę. Umyj szkiełka komory 3 razy w 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,0-7,2).
      2. f-actin.
         1. W przypadku barwienia immunofluorescencyjnego inkubuj komórki z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-króliczym przeciwko ZO-1 w 1:150, przygotowanym w 2% BSA-PBS na noc (O/N) w temperaturze 4 °C. Umyj komórki 3 razy w PBS (pH 7,0-7,2). Inkubować ze 100 μl drugorzędowego przeciwciała przeciw królikowi znakowanemu izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, bez glukozy	Gibco, Life technologies	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 dobrze sterylne, szklane szkiełka	Thermo scientific	177402
Wtórny anty-królik z tagiem FITC przeciwciało	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Można użyć dowolnego innego dostępnego PBS