Przeprowadzanie immunohistochemii na tkance mózgowej naczelnych innych niż człowiek

Streszczenie

Źródło: Eid, L. & Parent, M. Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż człowiek do wstępnego osadzenia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film pokazuje przygotowanie utrwalonej w aldehydach tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzka przy użyciu wstępnie osadzonej immunohistochemii do mikroskopii elektronowej. Przedstawiono w nim etapy znakowania immunologicznego określonego białka neuronalnego, po których następuje reakcja peroksydazy, która wytwarza kolorowy osad, umożliwiając wizualizację białka docelowego w mikroskopii elektronowej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Wstępne osadzanie immunohistochemii (ryc. 1C)

1. Przygotuj 4 l roztworu podstawowego soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS, 50 mM, pH 7,6) w następujący sposób.
   1. Odmierzyć 2 l wody destylowa....

Wyniki

Rysunek 1: Schematy podstawowych etapów Protokołu. Mózg małpy (A) jest cięty na szeregowe sekcje za pomocą wibratomu chłodzącego (B). Następnie jest przetwarzany.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dibasic anhydrous sodium phosphate	Fisher scientific	S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate	EM Science	SX0710-1
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	Rozcieńczenie 1N. Produkt jest żrący. Stosować z odpowiednią pochodnią.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N rozcieńczenie. Produkt jest żrący. Stosować z zachowaniem odpowiedniej ochrony.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% rozcieńczenie. Produkt jest wysoce lotny w postaci proszku i wysoce toksyczny. Używaj ostrożnie pod okapem wentylacyjnym z odpowiednią ochroną.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% rozcieńczenie. Produkt jest wysoce toksyczny. Stosować pod okapem wentylacyjnym z odpowiednią ochroną.
Stół wentylacyjny autopsji	Mopec	CE400
Elektroniczna pompa perfuzyjna	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Ostrza skalpela	Feather lance	201011 J9913	No.22 for surgery and No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Kalibruj ostrze przed każdym użyciem, gdy urządzenie na to pozwala
Vibratome razor	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% rozcieńczenie
Ethyle glycol	Fisher scientific	E178-4	30% rozcieńczenie
Sodium borohydride	sigma	S-9125
Normal horse surum	Jackson immunoResearch Laboratories	2% rozcieńczenie
Cold-fish gelatyna	Aurion	900.033	0,5% rozcieńczenia. Oryginalny produkt jest skoncentrowany na 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Biotynylowane przeciwciało wtórne, koza	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 rozcieńczenie
Biotynylowane przeciwciało wtórne, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 μL/ml A i B każdy
3'3 diaminobenzydyna (DAB)	Sigma	D5637	0,05% rozcieńczenie. Produkt jest wysoce lotny w postaci proszku i toksyczny. Nie wyrzucaj odpadów do zlewu.
Nadtlenek 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% rozcieńczenie

blade