Przeprowadzanie immunohistochemii na tkance mózgowej naczelnych innych niż człowiek

Streszczenie

Źródło: Eid, L. & Parent, M. Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż człowiek do wstępnego osadzenia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film pokazuje przygotowanie utrwalonej w aldehydach tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzka przy użyciu wstępnie osadzonej immunohistochemii do mikroskopii elektronowej. Przedstawiono w nim etapy znakowania immunologicznego określonego białka neuronalnego, po których następuje reakcja peroksydazy, która wytwarza kolorowy osad, umożliwiając wizualizację białka docelowego w mikroskopii elektronowej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Wstępne osadzanie immunohistochemii (ryc. 1C)

1. Przygotuj 4 l roztworu podstawowego soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS, 50 mM, pH 7,6) w następujący sposób.
   1. Odmierzyć 2 l wody destylowanej w zlewce o pojemności 4 l, dodać 24,23 g trihydroksymetyloaminometanu (THAM; C₄H₁₁NO₃) i mieszać do rozpuszczenia.
   2. Doprowadzić pH do 7,6 za pomocą około 148 ml 1 N HCl. Kwas należy dodawać ostrożnie, aby uniknąć osiągnięcia pH poniżej 7,6. Całkowita objętość powinna wynosić 4 L.
      UWAGA: HCl jest silnie żrący. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
2. Wybierz sekcje zawierające obszar zainteresowania, który ma być przetworzony pod kątem immunohistochemii EM.
3. Przemyć swobodnie pływające sekcje 3x w PBS (0,1 M, pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu wypłukania roztworu płynu niezamarzającego.
4. Przygotować 0,5% roztwór NaBH₄ rozcieńczony w PBS.
   1. Odważyć 0,05 g NaBH₄ i rozcieńczyć w 10 ml PBS. Nie zakrywaj. Przygotuj ten roztwór tuż przed użyciem.
5. Inkubować skrawki w świeżo przygotowanym roztworze NaBH₄ przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Nie zakrywaj.
6. Myć 3x w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej, energicznie kołysząc, aż nie pozostanie żaden z gazów reakcyjnych.
7. Przygotować roztwór blokujący dla EM z 2% odpowiedniej normalnej surowicy i 0,5% żelatyny z zimnej ryby rozcieńczonej w PBS.
   UWAGA: Ilość powinna zostać obliczona, aby wystarczyła na następujące trzy kroki. Należy użyć surowicy wykonanej z tego samego gatunku zwierząt, w którym znajduje się przeciwciało drugorzędowe. Należy unikać stosowania metod pobierania antygenu lub dodawania niewielkich ilości trytonu (w celu zwiększenia penetracji przeciwciał), ponieważ metody te znacznie pogarszają jakość tkanki.
8. Inkubować skrawki w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Delikatnie kołysać.
9. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała rozcieńczony w roztworze blokującym.
   UWAGA: Stężenie przeciwciała pierwszorzędowego jest zwykle takie samo jak immunohistochemii LM, ale rozważ wcześniejsze przeprowadzenie testów z różnymi stężeniami przeciwciał, ponieważ niektóre przeciwciała pierwszorzędowe mogą nie działać z akroleiną. Jeśli tak, możliwe jest użycie mieszaniny aldehydu glutarowego (0,1 - 2%) i 4% PFA do perfuzji przezsercowej i uzyskanie podobnych wyników. Zoptymalizuj również czas inkubacji i temperaturę.
10. Skrawki należy inkubować w roztworze przeciwciała pierwotnego przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc. Użyj wcześniej przetestowanego czasu inkubacji i temperatury.
11. Umyj sekcje 3x w PBS przez 5 min w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
12. Przygotować roztwór biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego w stosunku 1:1 000 rozcieńczonego w roztworze blokującym.
    UWAGA: Przeciwciało drugorzędowe musi być podniesione przeciwko gatunkom gospodarza użytym do wytworzenia przeciwciała pierwszorzędowego.
13. Inkubować skrawki w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Delikatnie rozdrabniać.
14. Przygotować roztwór peroksydazy awidyno-biotynowej (ABC) co najmniej 60 minut przed zakończeniem inkubacji przeciwciał wtórnych.
    1. Za pomocą skalibrowanej pipety odmierzyć 8,80 μl/ml roztworów A i B i rozcieńczyć je w PBS.
    2. Kołysać delikatnie przez co najmniej 60 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowite związanie cząsteczek awidyny i biotyny.
15. Po inkubacji w roztworze przeciwciała drugorzędowego przemyć 3x w PBS przez 10 minut w RT.
16. Inkubować skrawki w roztworze ABC przez 1 godzinę w RT. Delikatnie kołysać.
17. Prać raz w PBS i dwa razy w TBS przez 10 minut w temperaturze RT z delikatnym kołysaniem.
18. Przygotować świeży roztwór 0,05% 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) z 0,005% H₂O₂ rozcieńczony w TBS.
    1. Odważyć 12,5 mg DAB i rozcieńczyć w 25 ml zimnego TBS. Chronić przed światłem.
       UWAGA: Proszek DAB jest bardzo lotny i szkodliwy w przypadku wdychania. Jest rakotwórczy i teratogenny. Dlatego kobiety w ciąży lub karmiące piersią nie powinny manipulować tym produktem, nawet po rozcieńczeniu. Podczas manipulacji używaj maski N95 i noś środki ochrony osobistej.
    2. Przefiltruj roztwór i dodaj 4,5 μl 30% H₂O₂ tuż przed użyciem.
19. Inkubuj sekcje w roztworze DAB przez 3 do 7 minut w temperaturze pokojowej. Kołysz delikatnie.
    UWAGA: Brązowy osad nie powinien być zbyt ciemny, aby uniknąć dużego zabarwienia tła. Czas inkubacji powinien być odpowiednio zoptymalizowany.
20. Zatrzymaj reakcję, szybko myjąc dwa razy w zimnym TBS, następnie dwa razy przez 10 minut w zimnym TBS w RT, a następnie dwa razy przez 10 minut w PB, z łagodnym kołysaniem.
    UWAGA: Użycie PB (a nie PBS) jest kluczowe w celu wyeliminowania wszelkich śladów NaCl, ponieważ reagowałby on z osmem i tworzył kryształy.

Wyniki

Rysunek 1: Schematy podstawowych etapów Protokołu. Mózg małpy (A) jest cięty na szeregowe sekcje za pomocą wibratomu chłodzącego (B). Następnie jest przetwarzany...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dibasic anhydrous sodium phosphate	Fisher scientific	S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate	EM Science	SX0710-1
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	Rozcieńczenie 1N. Produkt jest żrący. Stosować z odpowiednią pochodnią.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N rozcieńczenie. Produkt jest żrący. Stosować z zachowaniem odpowiedniej ochrony.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% rozcieńczenie. Produkt jest wysoce lotny w postaci proszku i wysoce toksyczny. Używaj ostrożnie pod okapem wentylacyjnym z odpowiednią ochroną.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% rozcieńczenie. Produkt jest wysoce toksyczny. Stosować pod okapem wentylacyjnym z odpowiednią ochroną.
Stół wentylacyjny autopsji	Mopec	CE400
Elektroniczna pompa perfuzyjna	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Ostrza skalpela	Feather lance	201011 J9913	No.22 for surgery and No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Kalibruj ostrze przed każdym użyciem, gdy urządzenie na to pozwala
Vibratome razor	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% rozcieńczenie
Ethyle glycol	Fisher scientific	E178-4	30% rozcieńczenie
Sodium borohydride	sigma	S-9125
Normal horse surum	Jackson immunoResearch Laboratories	2% rozcieńczenie
Cold-fish gelatyna	Aurion	900.033	0,5% rozcieńczenia. Oryginalny produkt jest skoncentrowany na 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Biotynylowane przeciwciało wtórne, koza	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 rozcieńczenie
Biotynylowane przeciwciało wtórne, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 μL/ml A i B każdy
3'3 diaminobenzydyna (DAB)	Sigma	D5637	0,05% rozcieńczenie. Produkt jest wysoce lotny w postaci proszku i toksyczny. Nie wyrzucaj odpadów do zlewu.
Nadtlenek 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% rozcieńczenie

blade