$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
- Tissue Staining
- W światłoszczelnym pudełku do barwienia stwórz "komorę wilgotności" z niestrzępiących się chusteczek nasączonych dejonizowaną wodą.
- Osusz krawędzie szkiełka niestrzępiącą się chusteczką, użyj mini pisaka, aby zrobić odpychające płyny obramowanie na samej krawędzi szkiełka, z dala od sekcji tkanki. Granica ta powinna zapewniać wystarczającą przestrzeń między meniskiem cieczy a krawędzią tkanki, aby napięcie powierzchniowe nie wpływało na barwienie.
UWAGA: Obramowanie odstraszające długopisy papki może być nałożone przed 1.1.3, jeśli interesujące przeciwciała nie wymagają mikrofalowego pobierania antygenu. Jeśli wstrzykiwacz pap został nałożony przed praniem w PBS, na tym etapie należy sprawdzić integralność obrzeża odpychającego ciecze. Użyj pisaka mini-pap, aby wypełnić wszelkie luki w obramowaniu. - Za pomocą szkiełek ułożonych poziomo, zablokuj niespecyficzne wiązanie antygenu poprzez inkubację w surowicy 4% v/v w PBS (roztwór blokowy). Odpipetować 300 μl roztworu blokowego na szkiełko przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że roztwór blokowy rozciąga się do wstrzykiwacza pap na krawędzi szkiełka i całkowicie zakrywa tkankę, aby uniknąć nierównomiernego barwienia spowodowanego napięciem powierzchniowym w pobliżu tkanki.
- Użyj surowicy tego samego gatunku, w której wytwarzane jest przeciwciało drugorzędowe. Uwaga: W tej procedurze przeciwciała drugorzędowe są wytwarzane w osła, a zatem stosuje się surowicę osła. W przypadku stosowania przeciwciał drugorzędowych pochodzących od dwóch lub więcej różnych gatunków, należy dołączyć surowicę każdego gatunku.
- Pipetować przeciwciało pierwotne na szkiełka. Uwaga: Stężenia przeciwciał dla tego barwienia zostały zoptymalizowane na poziomie 1:5 000 i 1:500 odpowiednio dla Iba1 i Pan-neuronal. Stwierdzono, że stężenia te wykazują znaczące zabarwienie bez barwienia tła.
- Rozcieńczyć roztwór blokowy do 1% surowicy w PBS i dodać przeciwciała pierwszorzędowe. Odpipetować 300 μl roztworu przeciwciała pierwotnego w 1% surowicy na szkiełko. Ponownie upewnij się, że płyn znajduje się na krawędzi wstrzykiwacza. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Dołącz trzy slajdy kontrolne: jeden, który nie zawiera ani przeciwciał Iba1, ani przeciwciał Pan-neuronalnych, jeden z Iba1 bez przeciwciała Pan-neuronalnego i jeden z przeciwciałem Pan-neuronalnym bez Iba1. Wybarwić te szkiełka w tym samym przebiegu tymi samymi roztworami, jednak pominąć przeciwciała pierwszorzędowe, aby przetestować niespecyficzne wiązanie przeciwciał drugorzędowych.
- Następnego ranka umyj szkiełka trzy razy w PBS przez 5 minut każde, zmieniając roztwór między praniami.
- Przeciwciała fluorescencyjne są wrażliwe na światło, dlatego od tego kroku naprzód zminimalizuj ekspozycję na światło, upewniając się, że pojemniki do mycia są owinięte folią, a pudełka do hybrydyzacji są albo czarne, albo inkubowane w ciemności. Pobrać pipetę odpowiednich przeciwciał drugorzędowych na wszystkich szkiełkach i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej w stężeniu 1:250 w roztworze blokowym (patrz etap 1.2.3) w szczelnej "komorze wilgotnościowej" (patrz etap 1.2.1).
- Użyj przeciwciał drugorzędowych o różnych długościach fal. Tutaj, dla pierwszorzędowego przeciwciała królika anty-Iba1, użyj przeciwciała anty-królika 594 osła jako odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego. W przypadku pierwszorzędowego mysiego przeciwciała anty-Pan-neuronalnego należy użyć przeciwciała anty-mysiego 488 osła jako odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego. Alternatywnie użyj anty-królika 488 i anty-myszy 594.
- Umyj slajdy trzy razy w PBS przez 5 minut każdy.
- Opcjonalnie: wykonaj barwienie jądrowe.
- Umieść w Hoechst (lub innej plamie jądrowej) w stężeniu 0,03 μg/ml w podwójnie destylowanym H2O dokładnie przez 60 sekund.
- Umyj slajdy trzy razy w PBS przez 5 minut każdy.
- Wash in ddH2O.
- Coverslipping
- Szkiełka nakrywkowe z wodnym medium montażowym, takim jak Fluoromount-G lub ProlongGold. Uważaj, aby usunąć wszystkie bąbelki za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
Uwaga: Można użyć innych środków montażowych, jednak niektórzy zauważyli wysokie przebijanie między barwnikami w ciągu kilku dni od nałożenia szkiełka nakrywkowego. - Użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie, zapobiegając wysychaniu sekcji z powodu parowania. Pozostawić lakier do paznokci do wyschnięcia w światłoszczelnym pojemniku, podczas gdy szkiełka pozostaną płaskie i w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać w światłoszczelnym pojemniku owiniętym w folię w temperaturze 4 °C.