Ilościowe oznaczenie i analiza powstawania translokacji chromosomowych indukowanych przez endonukleazę HO poprzez odżarzanie pojedynczych nici w Saccharomyces cerevisiae

Podsumowanie

Test translokacji stymulowanej przez HO monitoruje proces wyżarzania pojedynczej nici po powstaniu pęknięć obu nici DNA w wielu loci u diploidalnych Saccharomyces cerevisiae. Mechanizm ten może służyć jako model przemieszczeń genomowych w komórkach somatycznych wyższych eukariotów po ekspozycji na wysokie dawki promieniowania jonizującego.

Streszczenie

Zmienność genetyczna jest często zapośredniczona przez reorganizacje genomowe, które powstają w wyniku interakcji między rozproszonymi elementami repetytywnymi obecnymi w każdym genomie eukariotycznym. Proces ten stanowi istotny mechanizm generowania różnorodności między organizmami oraz w ich obrębie^1-3. Genom ludzki składa się w około 40% z sekwencji repetytywnych pochodzenia retrotranspozonowego, w tym z różnych LINE i SINE⁴. Zdarzenia wymiany między tymi elementami repetytywnymi mogą prowadzić do reorganizacji genomu, w tym do translokacji, które mogą zaburzać dawkę oraz ekspresję genów, co może skutkować chorobami autoimmunologicznymi i sercowo-naczyniowymi⁵, a także nowotworami u ludzi^6-9.

Wymiana między elementami repetytywnymi zachodzi na różne sposoby. Wymiana między sekwencjami wykazującymi pełną (lub niemal pełną) homologię odbywa się w procesie zwanym rekombinacją homologiczną (HR). W przeciwieństwie do niej, niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) wykorzystuje niewielką lub żadną homologię sekwencji do przeprowadzenia wymiany^10,11. Głównym celem HR w komórkach mitotycznych jest naprawa pęknięć dwuniciowych (DSB) powstających endogennie w wyniku błędnej replikacji DNA i uszkodzeń oksydacyjnych lub w wyniku ekspozycji na promieniowanie jonizujące (IR) oraz inne egzogenne czynniki uszkadzające DNA.

W opisanym tutaj teście pęknięcia dwuniciowe (DSBs) są jednocześnie tworzone na granicach substratów rekombinacyjnych w dwóch różnych loci chromosomalnych w komórkach diploidalnych za pomocą indukowanej galaktozą endonukleazy HO (Rysunek 1). Naprawa pękniętych chromosomów generuje translokacje chromosomalne poprzez mechanizm SSA (single strand annealing), w którym sekwencje homologiczne sąsiadujące z końcami chromosomów zostają kowalencyjnie połączone po procesie hybrydyzacji. Jeden z substratów, his3-Δ3', zawiera allel HIS3 z uciętym końcem 3' i znajduje się na jednej kopii chromosomu XV w natywnym locus HIS3. Drugi substrat, his3-Δ5', znajduje się w locus LEU2 na jednej kopii chromosomu III i zawiera allel HIS3 z uciętym końcem 5'. Oba substraty są flankowane przez miejsce rozpoznawania endonukleazy HO, które może być celem nacięcia przez endonukleazę HO. Miejsca rozpoznawania endonukleazy HO natywne dla locus MAT, na obu kopiach chromosomu III, zostały usunięte we wszystkich szczepach. Zapobiega to oddziaływaniu między substratami rekombinacyjnymi a innymi pękniętymi końcami chromosomów, co mogłoby zakłócić przebieg testu. Kaseta ekspresyjna endonukleazy HO indukowana galaktozą z markerem KAN-MX jest wstawiona w locus TRP1 na chromosomie IV. Substraty dzielą 311 bp lub 60 bp sekwencji kodującej HIS3, które mogą zostać wykorzystane przez aparat HR do naprawy drogą SSA. Komórki, które wykorzystują te substraty do naprawy pękniętych chromosomów poprzez HR, tworzą nienaruszony allel HIS3 oraz translokację chromosomalną tXV::III, którą można wyselekcjonować na podstawie zdolności do wzrostu na podłożu pozbawionym histydyny (Rysunek 2A). Częstotliwość translokacji przez HR oblicza się, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych względem histydyny, które pojawiają się na podłożu selekcyjnym, przez całkowitą liczbę żywych komórek uzyskanych po wysianiu odpowiednich rozcieńczeń na podłożu nieselekcyjnym (Rysunek 2B). W tym systemie wykorzystano różne mutanty naprawy DNA do badania genetycznej kontroli powstawania translokacji drogą SSA^12-14.

Protokół

1. Częstotliwości translokacji stymulowanych przez HO

1. Zaszczep 10-20 niezależnych kultur o objętości 1 ml w podłożu YPGly/Lac (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 3% glicerolu i 3% mleczanu) pojedynczymi koloniami pożądanego genotypu. Inkubuj kultury przez noc lub przez czas wystarczający do osiągnięcia gęstości komórkowej około 5x10⁷-1x10⁸ cell/ml, w temperaturze 30°C na rotatorze lub przy delikatnym mieszaniu.
2. Dodaj do kultur galaktozę do stężenia końcowego 2%, aby indukowć pęknięcia dwuniciowe (DSBs) kierowane przez endonukleazę HO w substratach translokacji his3-Δ3' (chromosom III) i his3-Δ5' (chromosom XV).
3. Inkubuj przez 4 h w temperaturze 30°C na rotatorze lub przy delikatnym mieszaniu.
4. Po 4 h wysiej odpowiednie rozcieńczenia kultur na podłoże YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy), aby uzyskać około 100 do 200 kolonii na płytce, oraz wystarczającą liczbę komórek na podłoże pozbawione histydyny, aby uzyskać obserwowalną liczbę rekombinantowych kolonii His⁺. Inkubuj płytki w temperaturze 30°C przez dwa do trzech dni.

UWAGA: Krok 1.4 opisuje oznaczenie częstości translokacji w warunkach selekcyjnych poprzez wysiew kultur na podłoże pozbawione histydyny. Test ten można przeprowadzić również w warunkach nieselekcyjnych, wysiewając kultury na podłoże YPD, a następnie wykonując wysiew replikacyjny powstałych kolonii na płytki –His po dwóch lub trzech dniach. Metody te dają zbliżone częstości translokacji (Rysunek 2C).

5. Wyznacz częstotliwość translokacji, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych względem histydyny przez całkowitą liczbę wysianych żywych komórek (wyznaczoną poprzez wysianie rozcieńczeń na podłożu YPD). Oblicz medianę częstotliwości translokacji oraz 95% przedział ufności¹⁵.

2. Wydajność wysiewu

1. Pobrać aliquot komórek z każdej hodowli nocnej i określić liczbę komórek za pomocą licznika komórkowego (Baxter Healthcare Corporation. Catolog #: B3178-1).
2. Wysiać około 100 do 200 komórek na podłoże YPD, stosując odpowiednie rozcieńczenie. Inkubować przez dwa do trzech dni w temperaturze 30°C (np. dla hodowli o gęstości 1x10⁸ komórek/ml należy wysiać 100-200 μl rozcieńczenia 10-5 na płytkę).
3. Dodać do hodowli 20% galaktozy do stężenia końcowego 2%.
4. Po 4 h pobrać aliquot komórek z każdej hodowli, określić liczbę komórek za pomocą licznika komórkowego i wysiać około 100 do 200 komórek na podłoże YPD, stosując odpowiednie rozcieńczenie. Inkubować przez dwa do trzech dni w temperaturze 30°C.
5. Wyznaczyć wydajność wysiewu, dzieląc liczbę kolonii powstałych na podłożu YPD przez liczbę wysianych komórek, a następnie mnożąc otrzymany iloraz przez 100. Obliczyć medianę procentową z 95% przedziałem ufności.

3. Analiza genomiczna metodą Southern blot

1. Wybrać pojedynczą kolonię rekombinacyjną His⁺ z każdego niezależnego doświadczenia i przygotować DNA genomowe¹⁶.
2. Strawić około 4 μg DNA za pomocą endonukleazy restrykcyjnej BamHI.
3. Rozdzielić fragmenty strawione enzymem BamHI na żelu agarozowym 0,7% i przenieść je na dodatnio naładowaną membranę nylonową (Hybond N⁺, GE Healthcare. Numer produktu: RPN303B)¹⁷.
4. Przeprowadzić hybrydyzację z sondą znakowaną ³²P, otrzymaną metodą random priming (Amersham Biosciences. Numer produktu: RPN1604), wykorzystując klon genomowy BamHI/BamHI o wielkości 1,8 kb zawierający gen HIS3.
5. Wizualizować fragmenty DNA za pomocą autoradiografii lub obrazowania fosforowego.

4. Analiza chromosome blot z wykorzystaniem chromosomów rozdzielonych w jednorodnym polu elektrycznym o zmiennej konfiguracji (CHEF):

1. Przygotowanie chromosomów z wybranych rekombinantów His⁺ w czopkach agarozowych¹⁸:
   • Hodowlę płynną kandydującego rekombinanta His⁺ zawierającego chromosom tXV::III prowadzić w 5 ml pożywki YPD do uzyskania stężenia około 1-2 x 10⁸ komórek/ml.
   • Odwirować i przemyć komórki 2 razy w 50 mM EDTA.
   • Resuspendować komórki w około 200 μl 50 mM EDTA i ogrzać do 50°C.
   • Dodać taką samą objętość stopionej 2% (w/v) agarozy niskotopliwej rozgrzanej do 50°C, dokładnie wymieszać.
   • Rozlać aliquoty o objętości około 80 μl do form do czopków i pozostawić do schłodzenia na 30 min w 4°C.
   • Wysunąć czopki z formy do płytki 12-dołkowej. W każdym dołku można umieścić do pięciu czopków.
   • Do każdego dołka dodać 3 ml świeżo przygotowanego roztworu do sferoplastyki (14 mM 2-β-merkaptoetanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg/ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M sorbitol). Inkubować w 37°C przez 4 godziny przy łagodnym wytrząsaniu.
   • Usunąć roztwór do sferoplastyki i zastąpić go 3 ml roztworu LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA, 1% (w/v) dodecylosiarczanu litu, pH dostosowane do 8.0). Inkubować w 37°C przez 15 min przy łagodnym wytrząsaniu.
   • Usunąć roztwór LDS i zastąpić go kolejną 3 ml alikwotą LDS. Inkubować w 37°C przez noc przy łagodnym wytrząsaniu.
   • Usunąć LDS i zastąpić go 3 ml 0,2 X NDS (0,6 g zasady Tris, 93 g dwuwodnego EDTA dwusodowego, 5 g N-lauroylosarkozyny, pH dostosowane do 8.0, dopełnić do 500 ml wodą dH₂O). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min przy łagodnym wytrząsaniu. Usunąć NDS i powtórzyć czynność 2 razy.
   • Usunąć NDS i zastąpić go 3 ml buforu TE. Przemywać przy łagodnym wytrząsaniu przez 30 min w temperaturze pokojowej. Powtórzyć 4 razy.
   • Przechowywać czopki w 4°C w 2 ml buforu TE. Czopki mogą być przechowywane do roku.
2. Rozdzielić chromosomy na 1% żelu agarozowym przy użyciu aparatu Bio-Rad CHEF-DRII w 14°C (Katalog #: 170-3612).

Parametry: 1.^st blok: czas przełączania 70s, 15h przy 6V/cm.
2.^nd blok: czas przełączania 120s, 11h przy 6V/cm

3. Wizualizuj chromosomy poprzez barwienie 1μg/ml bromkiem etydyny przez 30 min, naświetlanie dawką 60 mJ UV w urządzeniu UV Stratalinker (Stratagene) oraz odbarwianie przez 30 min w dH₂O. Naświetlanie chromosomów zabarwionych bromkiem etydyny powoduje nacięcia w DNA, co umożliwia wydajny transfer na membranę.
4. Przenieś chromosomy na membranę dodatnio naładowaną (Hybond N+, GE Healthcare. Product Code: RPN303B) drogą kapilarną w warunkach denaturujących (0.4N NaOH, 1.5M NaCl).
5. Przeprowadź hybrydyzację z sondą znakowaną ³²P, otrzymaną metodą random priming (Amersham Biosciences. Product Code: RPN1604), z wykorzystaniem klonu genomicznego BamHI/BamHI o wielkości 1.8 kb zawierającego gen HIS3¹⁷.
6. Wizualizuj chromosomy za pomocą autoradiografii lub obrazowania fosforowego.

5. Reprezentatywne wyniki:

Graficzna reprezentacja testu translokacji przedstawiona jest na poziomie chromosomowym (Rycina 1). Przedstawiono również schemat procedury eksperymentalnej (Rycina 2A). Wydajność wysiewu przed i po indukcji określa się poprzez podzielenie całkowitej liczby żywych komórek tworzących kolonie przez całkowitą liczbę ciał komórkowych w hodowli, wyznaczoną za pomocą licznika hemocytometrem (Rycina 4B). Wydajności wysiewu przed i po indukcji nie różniły się istotnie dla komórek typu dzikiego (p-value= 0.1400) (Tabela 1).

Tabela 1. Wydajność wysiewania przed i po indukcji w komórkach typu dzikiego.

^a Liczbę ciał komórkowych na mililitr określa się za pomocą licznika komórek (hemacytometru).
^b Liczbę żywych komórek na mililitr określa się poprzez wysiew odpowiednich rozcieńczeń na podłoże nieselektywne w celu uzyskania ˜100-200 kolonii.
^cWydajność wysiewu przed i po indukcji określa się poprzez podzielenie całkowitej liczby żywych komórek tworzących kolonie przez całkowitą liczbę ciał komórkowych w hodowli, wyznaczoną za pomocą licznika komórek (hemacytometru).

Sugeruje to, że obecność lub brak któregokolwiek z chromosomów z translokacją nie wpływa na zdolność do przetrwania powstawania DSB. Częstotliwość translokacji chromosomowych można obliczyć, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych względem histydyny przez całkowitą liczbę żywych komórek wyznaczoną poprzez wysiew na podłoże YPD (Ryc. 2B). Analizę tę można przeprowadzić z użyciem szczepów o różnych genotypach, aby zidentyfikować, jak utrata funkcji białka wpływa na SSA (np. rad51Δ^-/-). Częstotliwości rekombinacji wyznaczone w różnych szczepach można następnie przedstawić na wykresie, aby porównać różnice w zdolności tych szczepów do naprawy DSB indukowanych przez endonukleazę HO za pomocą SSA (Ryc. 2C). Częstotliwości translokacji uzyskane dla diploidalnego szczepu typu dzikiego w warunkach selekcyjnych (2.2x10^-2) i nieselekcyjnych (2.17x10^-2) nie różniły się od siebie statystycznie (p-value= 0.9131), podczas gdy częstotliwości translokacji uzyskane selekcyjnie (6.0x10^-2) i nieselekcyjnie (11.9x10^-2) u homozygoty rad51Δ^-/- były podobne, lecz różniły się statystycznie (p-value= 0.0089). Częstotliwości uzyskane zarówno selekcyjnie (p-value=0.0001), jak i nieselekcyjnie (p-value=0.0002) u homozygoty rad51°^-/- różniły się statystycznie od tych uzyskanych w odpowiadających im warunkach dla szczepu typu dzikiego.

Klonów z domniemaną translokacją można poddać dalszej analizie za pomocą genomowej analizy Southern blot oraz analizy chromosomal blot (Rycina 3). W przypadku analizy Southern, DNA genomowe jest trawione endonukleazą BamHI przed elektroforezą w żelu agarozowym, transferem na membranę i hybrydyzacją z sondą HIS3 o długości 1,8 kb znakowaną ³²P, aby zwizualizować diagnostyczne fragmenty: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3', 4 kb tIII::XV, 5 kb tXV::III oraz 8 kb his3-Δ5' (Rycina 3B.1). Nienaruszone chromosomy można przygotować, rozdzielić metodą CHEF (Rycina 3B.2), przenieść na membranę nylonową i poddać hybrydyzacji z sondą HIS3 o długości 1,8 kb znakowaną ³²P, aby zwizualizować nienaruszony chromosom XV o wielkości 1,1 Mb, chromosom z translokacją tXV:III o wielkości 0,8 Mb, chromosom z translokacją tIII:XV o wielkości 0,6 Mb oraz nienaruszony chromosom III o wielkości 0,3 Mb (Rycina 3B.3). Przedstawiona jest mapa graficzna obrazująca oczekiwane fragmenty DNA genomowego trawionego endonukleazą BamHI oraz chromosomy rodzicielskie i rekombinowane (Rycina 3A).

Rycina 1. Powstawanie chromosomów translokacyjnych poprzez odżarzanie jednoniciowe (SSA). 1) DSB są tworzone w substratach his3-Δ3' oraz his3-Δ5' (odpowiednio w chromosomach XV i III) przez endonukleazę HO po dodaniu galaktozy do kultur. 2) DSB są przetwarzane w celu wygenerowania jednoniciowych końców 3' na końcach pękniętych chromosomów. 3) Aparat SSA odżarza komplementarne jednoniciowe sekwencje HIS3 o długości 311 lub 60 nukleotydów utworzone w każdym z substratów rekombinacji. Niehomologiczne ogony powstałe w wyniku odżarzania są usuwane poprzez trawienie endonukleazą. Komplementarne nawisy o długości 4 bp w pozostałych fragmentach chromosomowych utworzone przez trawienie endonukleazą HO mogą również ulec odżarzaniu. 4) Ligacja kończy proces tworzenia nienaruszonego genu HIS3 oraz chromosomu translokacyjnego tXV::III poprzez SSA. Komórki posiadające ten chromosom można wyselekcjonować na podstawie ich zdolności do wzrostu na pożywce pozbawionej histydyny. Ligacja może również prowadzić do powstania odwrotnego chromosomu translokacyjnego tIII::XV poprzez mechanizm podobny do NHEJ.

Rycina 2. Test określania częstotliwości translokacji przez SSA. A) Jeden ml kultur YPGly/Lac szczepionych jest pojedynczymi koloniami komórek o wybranym genotypie i hodowanych do odpowiedniej gęstości wynoszącej około 5x10⁷-1x10⁸ komórek/ml. Dodaje się galaktozę do stężenia końcowego 2%, aby wywołać pęknięcia dwuniciowe (DSBs) w substratach rekombinacyjnych na chromosomach III i XV. Aby przeprowadzić test w warunkach selekcyjnych, wykonuje się odpowiednie rozcieńczenia w taki sposób, aby na pożywkę YPD wysiać około 100 do 200 komórek, a na pożywkę pozbawioną histydyny wysiać wystarczającą liczbę komórek, by uzyskać obserwowalną liczbę rekombinowanych kolonii His⁺. Aby przeprowadzić test bez selekcji, około 100 do 200 komórek wysiewa się na YPD, hoduje przez dwa do trzech dni do momentu powstania pojedynczych kolonii, a następnie przenosi metodą replica plating na pożywkę pozbawioną histydyny. B) Częstotliwość translokacji można określić, dzieląc liczbę kolonii rosnących na płytkach –His przez frakcję rosnącą na YPD. C) Częstotliwości translokacji szczepów o różnych genotypach (tj. typu dzikiego oraz rad51Δ^-/-) można przedstawić na wykresie w celu porównania różnic w zdolności tych szczepów do naprawy DSBs drogą SSA.

Rycina 3. Wyznaczanie wydajności wysiewu. (A) Przed i po indukcji DSB z kultury nocnej pobiera się alikwot komórek, wykonuje odpowiednie rozcieńczenia, a następnie przeprowadza liczenie w komorze hemacytometrycznej w celu określenia całkowitej liczby komórek w ml kultury. Odpowiednie rozcieńczenia wysiewa się na podłoże nieselektywne, aby określić całkowitą liczbę żywych komórek w ml poprzez zliczenie kolonii pojawiających się na podłożu YPD. (B) Wydajność wysiewu wyznacza się następnie poprzez podzielenie całkowitej liczby żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek i pomnożenie uzyskanego ilorazu przez 100.

Rycina 4. Wykrywanie zdarzeń translokacji chromosomowych za pomocą analizy Southern blot DNA genomowego oraz chromosome blot.
A) Graficzna reprezentacja odpowiednich chromosomów przed (lewo) i po (prawo) powstaniu translokacji.
Wielkości chromosomów rodzicielskich i rekombinacyjnych podano w megoparach zasad (Mb). Wielkości fragmentów restrykcyjnych zawierających odpowiednie sekwencje, wygenerowanych poprzez trawienie BamHI DNA genomowego szczepów rodzicielskich i rekombinacyjnych i uwidocznionych na blotach poprzez hybrydyzację z 1,8 kb genomowym klonem BamHI HIS3, podano w kiloparach zasad (kb). Chromosomy nie są narysowane w skali.
B) Analiza fizyczna domniemanych klonów z translokacją.
(1) Analiza Genomic Southern blot – DNA genomowe zostało wyizolowane i strawione endonukleazą restrykcyjną BamHI, rozdzielone za pomocą elektroforezy żelowej, przeniesione na membranę nylonową i poddane hybrydyzacji z sondą HIS3 1,8 kb znakowaną ³²P w celu uwidocznienia następujących fragmentów: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3', 4 kb tIII::XV, 5 kb tXV::III oraz 8 kb his3-Δ5'. Ścieżki: a) diploida rodzicielska, b) rekombinant z niezwrotną translokacją His⁺, c) rekombinant ze zwrotną translokacją His⁺.
(2) Żele CHEF – Nienaruszone chromosomy przygotowano w czopach agarozy, rozdzielono metodą CHEF, zabarwiono bromkiem etydyny i uwidoczniono w świetle UV. Ścieżki: jak wyżej.
(3) Chromosome blots – Rozdzielone chromosomy przeniesiono na membranę nylonową i poddano hybrydyzacji z sondą HIS3 1,8 kb znakowaną ³²P w celu uwidocznienia następujących chromosomów: 1,1 Mb nienaruszony chromosom XV, 0,8 Mb chromosom translokacyjny tXV:III, 0,6 Mb chromosom translokacyjny tIII:XV oraz 0,3 Mb nienaruszony chromosom III. Ścieżki: jak wyżej.

Dyskusja

Wysokie dawki promieniowania jonizującego niosą ze sobą immanentne ryzyko niestabilności genomu poprzez generowanie licznych DSB¹⁹. Genomy eukariotyczne obfitują w sekwencje repetytywne, które stanowią doskonałe substraty do powstawania translokacji i innych rearanżacji genomowych^20,21. Translokacje chromosomalne zachodzące drogą HR są często obserwowane, gdy DSB są wprowadzane pomiędzy sekwencje repetytywne^12,21,22. Przekonujące dowody sugerują, że znaczną część niestabilności genomowej związanej z białaczkami i chłoniakami można przypisać translokacjom chromosomalnym, co podkreśla wagę zrozumienia mechanizmu ich powstawania u eukariotów^22,23. Opracowaliśmy system w drożdżach pączkujących do badania formowania chromosomów translokacyjnych poprzez indukowaną DSB HR pomiędzy krótkimi regionami homologii na różnych chromosomach, których rozmiar jest zbliżony do elementów repetytywnych rozproszonych w genomach drożdży i ludzi.

W tym teście substrat translokacji his3-Δ3' znajduje się na jednej kopii chromosomu XV. Drugi allel his3 (his3-Δ200) posiada delecję ok. 1kb promotora i sekwencji kodującej HIS3, co zapobiega wykorzystaniu tej sekwencji jako matrycy do naprawy²⁴. Substrat his3-Δ5' znajduje się w locus LEU2 na jednej kopii chromosomu III, podczas gdy druga kopia chromosomu III zawiera niezmieniony allel LEU2 (Rycina 1). Kaseta ekspresyjna endonukleazy HO indukowana galaktozą, oznakowana KAN-MX, została wstawiona do locus TRP1 chromosomu IV (trp1::GAL-HO-KAN-MX). Każdy substrat translokacji jest flankowany przez sekwencję rozpoznawania endonukleazy HO, która może zostać poddana cięciu poprzez indukcję ekspresji genu HO za pomocą dodania galaktozy do pożywki. Po cięciu substratów his3-Δ3' oraz his3-Δ5' indukowanym przez endonukleazę HO, komórki mogą efektywnie wykorzystać wspólny krótki odcinek homologii sekwencji HIS3 (311 bp lub 60 bp), aby naprawić uszkodzone chromosomy w drodze HR, generując chromosom translokowany z nienaruszonym allelem HIS3^12-14,25.

Ponieważ komórki rodzicielskie nie posiadają nienaruszonej kopii genu HIS3, nie są one w stanie rosnąć na podłożu –His. Na podłożu pozbawionym histydyny można wyselekcjonować jedynie komórki, w których doszło do translokacji. W związku z tym częstotliwość translokacji chromosomowych można obliczyć, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych względem histydyny przez całkowitą liczbę żywotnych komórek wysianych, określoną poprzez wysiew na podłoże YPD. Następnie z reprezentatywnych kolonii His⁺ można wyizolować DNA genomowe i nienaruszone chromosomy, a obecność chromosomu z translokacją zweryfikować za pomocą analizy Southern blot DNA genomowego oraz analizy chromosome blot.

Dokładna analiza pozwoliła nam zebrać dodatkowe istotne informacje na temat testu¹². Analiza genomiczna metodą Southern blot dostarczyła dowodów na niemal całkowite cięcie chromosomów XV i III po 30 minutach indukcji endonukleazy HO, w związku z czym w populacji nie występuje istotne tło nieprzeciętych substratów chromosomalnych (G. Manthey & A. Bailis, wyniki niepublikowane). Analizy genomiczne Southern blot oraz chromosome blot przeżywalników His^- wskazują, że komórki często tracą jeden, drugi lub oba przecięte chromosomy, a mimo to pozostają żywotne (L. Liddell & A. Bailis, wyniki niepublikowane). Co istotne, niemal równa wydajność wysiewu na podłożu nieselektywnym przed i po indukcji ekspresji endonukleazy HO wskazuje, że ani brak naprawy uszkodzonych chromosomów, ani brak zachowania chromosomów translokacyjnych nie wpływa na zdolność do przeżycia po powstaniu DSB. Zgodnie z tym wykazano, że chromosom translokacyjny tXV:III jest niestabilny w komórkach mitotycznych w warunkach braku selekcji. Zademonstrowano to poprzez nocną hodowlę rekombinantów His⁺ zawierających tXV::III na podłożu nieselektywnym, wysiewanie pojedynczych kolonii na płytki nieselektywne, a następnie przenoszenie ich metodą replica plating na podłoże selektywne pozbawione histydyny. Od 10% do 70% kolonii powstałych na tych płytkach utraciło chromosom translokacyjny tXV::III (N. Pannunzio & A. Bailis, wyniki niepublikowane).

Chromosomy z translokacjami powstałe w wyniku ekspozycji na promieniowanie jonizujące (IR) u ludzi wykazują podobną niestabilność²⁶. Sugeruje to, że powstawanie translokacji może przyczyniać się do wczesnych zdarzeń w procesie tumorigenzy poprzez promowanie utraty heterozygotyczności. Po drugie, rozległe analizy genetyczne i molekularne wskazują, że SSA, wydajny i obligatoryjnie niekonserwatywny mechanizm HR, jest głównym mechanizmem powstawania translokacji poprzez HR po jednoczesnym powstaniu DSBs na dwóch chromosomach^12,27,28. Jest to zgodne z odkryciem, że duże dawki IR prowadzą do gęstości DSBs wystarczającej do stworzenia pęknięć w sąsiedztwie wielu sekwencji repetytywnych w genomie drożdży oraz do wysokiej częstotliwości powstawania translokacji przez HR. Wspólnie obserwacje te sugerują, że onkogenny efekt ekspozycji na IR u ludzi może w części wynikać z naprawy DSBs za pomocą wydajnego mechanizmu HR, który generuje translokacje, które poprzez swoją immanentną niestabilność promują zmiany genetyczne inicjujące tumorigenzę. Ponieważ promieniowanie jest często stosowane w leczeniu nowotworów, przegrupowania genomu wynikające z naprawy indukowanych promieniowaniem DSBs mogą przyczyniać się do powstawania nowotworów wtórnych, które często pojawiają się u pacjentów. Zatem model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu podstaw genetycznych i molekularnych istotnej odpowiedzi klinicznej na leczenie IR.