Kwantyfikacja i analiza powstawania translokacji chromosomowych stymulowanych przez endonukleazę HO przez wyżarzanie jednoniciowe u Saccharomyces cerevisiae

Podsumowanie

Test translokacji stymulowany przez HO monitoruje wyżarzanie pojedynczej nici po utworzeniu pęknięć dwuniciowych DNA w wielu loci u diploidalnych Saccharomyces cerevisiae. Mechanizm ten może modelować rearanżacje genomu w komórkach somatycznych wyższych eukariontów po ekspozycji na wysokie dawki promieniowania jonizującego.

Streszczenie

Zmienność genetyczna jest często zapośredniczona przez przegrupowania genomowe, które powstają w wyniku interakcji między rozproszonymi powtarzalnymi elementami obecnymi w każdym genomie eukariotycznym. Proces ten jest ważnym mechanizmem generowania różnorodności między organizmami i w ich obrębie^1-3. Ludzki genom składa się w około 40% z powtarzających się sekwencji pochodzenia retrotranspozonowego, w tym z różnych LINE i SINEs⁴. Zdarzenia wymiany między tymi powtarzającymi się elementami mogą prowadzić do rearanżacji genomu, w tym translokacji, które mogą zakłócić dawkowanie i ekspresję genów, co może prowadzić do chorób autoimmunologicznych i sercowo-naczyniowych⁵, a także raka u ludzi^6-9.

Wymiana między powtarzającymi się elementami odbywa się na różne sposoby. Wymiana między sekwencjami, które mają idealną (lub prawie doskonałą) homologię, zachodzi w procesie zwanym rekombinacją homologiczną (HR). Natomiast niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) wykorzystuje homologię sekwencji o małej lub zerowej liczbie do wymiany^10,11. Głównym celem HR w komórkach mitotycznych jest naprawa pęknięć dwuniciowych (DSB) generowanych endogennie przez nieprawidłową replikację DNA i zmiany oksydacyjne lub przez ekspozycję na promieniowanie jonizujące (IR) i inne egzogenne czynniki uszkadzające DNA.

W opisanym tutaj teście, DSB są jednocześnie tworzone graniczące z substratami rekombinacji w dwóch różnych loci chromosomowych w komórkach diploidalnych przez indukowaną galaktozą endonukleazę HO (Rysunek 1). Naprawa uszkodzonych chromosomów generuje translokacje chromosomowe przez wyżarzanie pojedynczej nici (SSA), proces, w którym sekwencje homologiczne sąsiadujące z końcami chromosomów są kowalencyjnie łączone po wyżarzaniu. Jeden z substratów, his3-Δ3', zawiera skrócony allel HIS3 o długości 3' i znajduje się na jednej kopii chromosomu XV w natywnym locus HIS3. Drugi substrat, his3-Δ5', znajduje się w locus LEU2 na jednej kopii chromosomu III i zawiera skrócony allel HIS3 o długości 5'. Oba substraty są otoczone miejscem rozpoznawania endonukleazy HO, które może być celem do nacięcia przez endonukleazę HO. Miejsca rozpoznawania endonukleazy HO natywne dla locus MAT, na obu kopiach chromosomu III, zostały usunięte we wszystkich szczepach. Zapobiega to interferencji w teście między substratami rekombinacji a innymi uszkodzonymi końcami chromosomów. Kaseta ekspresji endonukleazy HO indukowanej galaktozą KAN-MX jest wprowadzana do locus TRP1 na chromosomie IV. Substraty mają wspólne 311 pz lub 60 pz sekwencji kodującej HIS3, która może być wykorzystana przez maszynerię HR do naprawy przez SSA. Komórki, które wykorzystują te substraty do naprawy uszkodzonych chromosomów przez HR, tworzą nienaruszony allel HIS3 i translokację chromosomową tXV::III, którą można wybrać ze względu na zdolność do wzrostu na pożywce pozbawionej histydyny (ryc. 2A). Częstość translokacji przez HR oblicza się, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych histydyny, które powstają na pożywce selektywnej, przez całkowitą liczbę żywotnych komórek, które powstają po posiewie odpowiednich rozcieńczeń na pożywce nieselektywnej (ryc. 2B). Różne mutanty naprawy DNA zostały wykorzystane do zbadania genetycznej kontroli tworzenia translokacji przez SSA przy użyciu tego systemu^12-14.

Protokół

1. Częstotliwości translokacji stymulowane przez HO

1. Zaszczepić 10-20 niezależnych 1 ml kultur pożywki YPGly/Lac (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 3% glicerolu i 3% mleczanu) pojedynczymi koloniami o pożądanym genotypie. Inkubować kultury przez noc lub przez wystarczająco dużo czasu, aby osiągnąć gęstość komórek około 5x10 7-1x10⁸ komórek/ml, w temperaturze 30°C na rotatorze lub przy delikatnym mieszaniu.
2. Dodać galaktozę do kultur do końcowego stężenia 2%, aby indukować DSB skierowane endonukleazą HO na substratach translokacji his3-Δ3' (chromosom III) i his3-Δ5' (chromosom XV).
3. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 30°C na rotatorze lub delikatnie mieszając.
4. Po 4 godzinach należy rozcieńczyć kultury na YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy), aby uzyskać około 100 do 200 kolonii na płytkę i wystarczającą liczbę komórek na pożywce pozbawionej histydyny, aby uzyskać obserwowalną liczbę rekombinowanych kolonii His⁺. Inkubować płytki w temperaturze 30°C przez dwa do trzech dni.

UWAGA: Krok 1.4 opisuje określanie częstotliwości translokacji w warunkach selektywnych poprzez posiewanie kultur na pożywce pozbawionej histydyny. Test ten można również przeprowadzić w warunkach nieselektywnych, posiewając kultury na YPD, a następnie replikując posiewy kolonii, które pojawiają się na płytkach –He dwa do trzech dni później. Metody te dają podobne częstotliwości translokacji (ryc. 2C).

5. Określ częstość translokacji, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych histydyny przez całkowitą liczbę żywotnych komórek posianych (oznaczoną przez rozcieńczenia posiewu na YPD). Określ medianę częstości translokacji i 95% przedział ufności¹⁵.

2. Wydajność poszycia

1. Usunąć podwielokrotność komórek z każdej nocnej hodowli i określić liczbę komórek za pomocą liczby hemacytometru (Baxter Healthcare Corporation. Katolog #: B3178-1).
2. Umieścić około 100 do 200 komórek na płytce YPD, stosując odpowiednie rozcieńczenie. Inkubować przez dwa do trzech dni w temperaturze 30°C (np. W przypadku hodowli o gęstości komórek 1x10⁸ komórek/ml należy podać 100-200 μl w rozcieńczeniu 10-5 na płytkę).
3. Dodaj 20% galaktozy do kultur do końcowego stężenia 2%.
4. Po 4 godzinach usunąć podwielokrotność komórek z każdej hodowli, oznaczyć liczbę komórek za pomocą liczby hemacytometru i rozszczepić około 100 do 200 komórek, stosując odpowiednie rozcieńczenie na YPD. Inkubować przez dwa do trzech dni w temperaturze 30°C.
5. Określ wydajność posiewu, dzieląc liczbę kolonii pojawiających się na YPD przez liczbę platerowanych komórek i mnożąc ten iloraz przez 100. Określ medianę procentową z 95% przedziałem ufności.

3. Genomowa analiza Southern blot

1. Wybierz pojedynczą rekombinowaną kolonię His⁺ z każdej niezależnej próby i przygotuj genomowe DNA¹⁶.
2. Strawić około 4 μg DNA za pomocą endonukleazy restrykcyjnej BamHI.
3. Oddziel strawione fragmenty BamHI na 0,7% żelu agarozowym i przenieś do dodatnio naładowanej membrany nylonowej (Hybond ^N+, GE Healthcare. Kod produktu: RPN303B)¹⁷.
4. Hybrydyzacja z sondą znakowaną ³²P uzyskaną przez losowe torowanie (Amersham Biosciences. Kod produktu: RPN1604) z klonem genomowym BamHI/BamHI o wielkości 1,8 kb zawierającym gen HIS3.
5. Wizualizacja fragmentów DNA za pomocą autoradiografii lub fosforowania.

4. Analiza plam chromosomowych przy użyciu chromosomów rozdzielonych w jednorodnym polu elektrycznym z zaciśniętym konturem (CHEF):

1. Preparatyzować chromosomy z wybranych rekombinantów His⁺ w zatyczkach agarozowych¹⁸:
   • Wyhodować płynną kulturę rekombinowanego chromosomu His⁺ zawierającego chromosom tXV::III w 5 ml YPD do około 1-2 x 10⁸ komórek/ml.
   • Odkręć i umyj ogniwa 2 razy za pomocą 50 mM EDTA.
   • Zawieś komórki w około 200 μl 50 mM EDTA i ogrzej do 50°C.
   • Dodać równą objętość stopionej 2% (w/v) niskotopliwej agarozy doprowadzonej do 50°C, dokładnie wymieszać.
   • Dozować około 80 μl porcji do foremek korkowych i pozostawić do ostygnięcia przez 30 minut w temperaturze 4°C.
   • Wyciśnij korki z formy do 12-dołkowego naczynia. W każdej studzience można umieścić do pięciu zatyczek.
   • Dodać 3 ml świeżo przygotowanego roztworu sferoplastycznego (14 mM 2-β-merkaptoetanolu, 20 mM EDTA, 0,5 mg/ml Zymoliazy 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M sorbitolu) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37°C przez 4 godziny, delikatnie mieszając.
   • Usuń roztwór sferoplastyczny i zastąp go 3 ml roztworu LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w/v) dodecylosiarczanu litu, dostosować pH do 8,0). Inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut, delikatnie mieszając.
   • Usunąć roztwór LDS i zastąpić go kolejną 3 ml porcją LDS. Inkubować w temperaturze 37°C przez noc, delikatnie mieszając.
   • Usunąć LDS i zastąpić 3 ml 0,2 X NDS (0,6 g zasady Tris, 93 g disodowej EDTA dwuwodnej, 5 g N-lauroilosarosyny, dostosować pH do 8,0, doprowadzić do 500 ml z_dH2O). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut z delikatnym mieszaniem. Usuń NDS i powtórz 2 razy.
   • Usuń NDS i zastąp 3 ml TE. Myć z delikatnym mieszaniem przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz 4 razy.
   • Przechowywać korki w temperaturze 4°C w 2 ml TE. Wtyczki mogą być przechowywane do roku.
2. Oddziel chromosomy na 1% żelu agarozowym za pomocą aparatu Bio-Rad CHEF-DRII w temperaturze 14°C (Katalog #: 170-3612).

Parametry: 1. blok: czas przełączania 70s, 15h przy 6V/cm.
2. blok: czas przełączania 120 s, 11 godzin przy 6 V / cm

3. Wizualizacja chromosomów poprzez barwienie 1 μg/ml bromku etydyny przez 30 minut, naświetlanie 60 mJ promieniowania UV w UV Stratalinker (Stratagene) i odbarwianie przez 30 minut w dH₂O. Napromienianie chromosomów barwionych bromkiem etydyny nacina DNA, aby umożliwić skuteczne przeniesienie do błony.
4. Przenieś chromosomy do dodatnio naładowanej błony (Hybond N+, GE Healthcare. Kod produktu: RPN303B) przez działanie kapilarne w warunkach denaturacji (0,4 N NaOH, 1,5 M NaCl).
5. Hybrydyzacja z sondą znakowaną ³²P uzyskaną przez losowe torowanie (Amersham Biosciences. Kod produktu: RPN1604) z klonem genomowym BamHI/BamHI o pojemności 1,8 kb zawierającym gen HIS3 ¹⁷.
6. Wizualizacja chromosomów za pomocą autoradiografii lub fosforyzacji.

5. Reprezentatywne wyniki:

Graficzna reprezentacja testu translokacji jest przedstawiona na poziomie chromosomów (Rysunek 1). Wyświetlany jest również schemat procedury doświadczalnej (rysunek 2A). Zarówno wydajność posiewu przed, jak i po indukcji określa się, dzieląc całkowitą liczbę żywotnych komórek tworzących kolonie przez całkowitą liczbę ciał komórkowych w kulturze, określoną za pomocą liczby hemacytometru (Figura 4B). Wydajność posiewu przed i po indukcji nie różniła się istotnie dla ogniw typu dzikiego (wartość p = 0,1400) (Tabela 1).

Tabela 1. Wydajność powlekania przed i po indukcji w ogniwach typu dzikiego.

^a Liczba ciał komórkowych na mililitr jest określana przez liczbę hemacytometrów.
^b Liczbę żywotnych komórek na mililitr określa się przez posiew odpowiednich rozcieńczeń na nieselektywnej pożywce w celu wytworzenia ̃100-200 kolonii.
^cSkuteczność posiewu przed i po indukcji określa się, dzieląc całkowitą liczbę żywotnych komórek tworzących kolonie przez całkowitą liczbę ciał komórkowych w hodowli, określoną za pomocą liczby hemacytometru.

To sugeruje, że obecność lub brak któregokolwiek z chromosomów translokacyjnych nie wpływa na zdolność do przetrwania formowania DSB. Częstość translokacji chromosomowych można obliczyć, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych histydyny przez całkowitą liczbę żywotnych komórek określoną przez posiew na YPD (ryc. 2B). Test ten można przeprowadzić przy użyciu szczepów o różnym genotypie, aby określić, w jaki sposób utrata funkcji białka wpływa na SSA (tj. rad51Δ^-/-). Częstości rekombinacji określone w różnych szczepach można następnie przedstawić na wykresie, aby porównać różnice w zdolności tych szczepów do naprawy DSB indukowanych przez endonukleazę HO przez SSA (Figura 2C). Częstości translokacji uzyskane za pomocą szczepu diploidalnego typu dzikiego w warunkach selektywnych (2,2x10-2) i nieselektywnych (2,17x10-2) nie różniły się statystycznie od siebie (wartość p = 0,9131), podczas gdy częstości translokacji uzyskano selektywnie (6,0x10-2) i nieselektywnie (11,9x10-2) za pomocą rad51Δ^-/- homozygoty były podobne, ale statystycznie różne (wartość p = 0,0089). Częstości uzyskane zarówno selektywnie (wartość p=0,0001), jak i nieselektywnie (wartość p=0,0002) z homozygotą rad51°^-/- różniły się statystycznie od tych uzyskanych przy użyciu odpowiednich warunków ze szczepem typu dzikiego.

Przypuszczalne klony przenoszące translokację mogą być dalej badane za pomocą genomowych analiz Southern blot i chromosomal blot (Rysunek 3). W przypadku analizy południowej, genomowe DNA jest trawione endonukleazą BamHI przed elektroforezą w żelu agarozowym, blottingiem i hybrydyzacją do sondy HIS3 o znakowaniu ³²znakowanymi P 1,8 kb w celu wizualizacji diagnostycznych 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3', 4 kb tIII::XV, 5 kb tXV::III i 8 kb his3-Δ5' fragmentów (Figura 3B.1). Nienaruszone chromosomy można przygotować, rozdzielić za pomocą CHEF (ryc. 3B.2), osuszyć do nylonu i zhybrydyzować z sondą HIS3 znakowaną ³²P o pojemności 1,8 kb w celu uwidocznienia 1,1 Mb nienaruszonego chromosomu XV, 0,8 Mb chromosomu translokacji tXV:III, 0,6 Mb chromosomu translokacyjnego tIII:XV i 0,3 Mb nienaruszonego chromosomu III (ryc. 3B.3). Przedstawiono mapę graficzną przedstawiającą oczekiwane fragmenty genomowego DNA trawione przez endonukleazę BamHI oraz chromosomy rodzicielskie i rekombinowane (Figura 3A).

Rysunek 1. Tworzenie chromosomów translokacyjnych przez wyżarzanie jednoniciowe (SSA). 1) DSB są tworzone na substratach his3-Δ3' i his3-Δ5' (odpowiednio chromosomy XV i III) przez endonukleazę HO po dodaniu galaktozy do kultur. 2) DSB są przetwarzane w celu wytworzenia pojedynczych nici 3' na końcach uszkodzonych chromosomów. 3) Wyżarzanie maszyn SSA komplementarne 311 lub 60 jednoniciowych nukleotydowych sekwencji HIS3 utworzonych na każdym z substratów rekombinacji. Niehomologiczne ogony powstałe podczas wyżarzania są usuwane przez trawienie endonukleazą. Komplementarne cztery nawisy pz na pozostałych fragmentach chromosomów powstałych w wyniku trawienia endonukleazy HO mogą również wyżarzać. 4) Podwiązanie kończy tworzenie nienaruszonego genu HIS3 i chromosomu translokacji tXV::III przez SSA. Komórki posiadające ten chromosom mogą być selekcjonowane na podstawie ich zdolności do wzrostu na pożywce pozbawionej histydyny. Podwiązanie może również generować odwrotny chromosom translokacji tIII::XV za pomocą mechanizmu podobnego do NHEJ.

Rysunek 2. Test do określania częstości translokacji przez SSA. A) Jeden ml kultur YPGly/Lac zaszczepia się pojedynczymi koloniami komórek wybranego genotypu i hoduje do odpowiedniej gęstości około 5x10 7-1x10⁸ komórek/ml. Galaktoza jest dodawana do końcowego stężenia 2% w celu wytworzenia DSB na substratach rekombinacyjnych na chromosomach III i XV. Aby przeprowadzić test w warunkach selektywnych, wykonuje się odpowiednie rozcieńczenia, tak aby około 100 do 200 komórek zostało posianych na YPD, a wystarczająca liczba komórek została posiewana na pożywce pozbawionej histydyny, aby uzyskać obserwowalną liczbę rekombinowanych kolonii His⁺. Aby przeprowadzić test bez selekcji, około 100 do 200 komórek jest posiewanych na YPD, hodowanych przez dwa do trzech dni do pojedynczych kolonii, a następnie replikowanych posiewów na pożywce pozbawionej histydyny. B) Częstotliwość translokacji można określić, dzieląc liczbę kolonii, które rosną na płytkach –He przez frakcję, która rośnie na YPD. C) Częstości translokacji szczepów o różnym genotypie (tj. typu dzikiego i rad51Δ^-/-) można przedstawić na wykresie w celu porównania różnic w zdolności tych szczepów do naprawy DSB przez SSA.

Rysunek 3. Określanie wydajności galwanizacji. (A) Z hodowli nocnej pobiera się podwielokrotność komórek przed i po indukcji DSB, dokonuje się odpowiednich rozcieńczeń, a następnie zlicza się hemacytometrem w celu określenia całkowitej liczby ciał komórkowych na ml hodowli. Odpowiednie rozcieńczenia rozsiewa się na nieselektywnej pożywce w celu określenia całkowitej liczby żywotnych komórek na ml, licząc kolonie, które pojawiają się na YPD. (B) Wydajność posiewu określa się następnie poprzez podzielenie całkowitej liczby żywotnych komórek przez całkowitą liczbę ciał komórkowych i pomnożenie tego ilorazu przez 100.

Rysunek 4. Wykrywanie zdarzeń translokacji chromosomowej za pomocą genomowych analiz Southern blot i chromosome blot.
A) Graficzne przedstawienie odpowiednich chromosomów przed (po lewej) i po (po prawej) powstaniu translokacji.
Rozmiary chromosomów rodzicielskich i rekombinowanych są podane w parach megazasad (Mb). Rozmiary fragmentów restrykcyjnych zawierających odpowiednie sekwencje wygenerowane przez trawienie BamHI genomowego DNA ze szczepów rodzicielskich i rekombinowanych i ujawnione na blot przez hybrydyzację z klonem genomowym BamHI HIS3 o wielkości 1,8 kb, są wymienione w kiloparach zasad (kb). Chromosomy nie są rysowane w skali.
B) Fizyczna analiza przypuszczalnych klonów przenoszących translokację.
(1) Genomowa analiza Southern blot - Genomowe DNA pobrano i strawiono endonukleazą restrykcyjną BamHI, frakcjonowano za pomocą elektroforezy żelowej, osuszono do nylonu i zhybrydyzowano z sondą HIS3 znakowaną ³²P, 1,8 kb w celu wizualizacji następujących fragmentów: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3', 4 kb tIII::XV, 5 kb tXV::III, i 8 kb his3-Δ5'. Pasy: a) diploidalny nadrzędny, b) His⁺ translokacja niewzajemna rekombinowana, c) Jego⁺ translokacja wzajemna rekombinowana.
(2) Żele CHEF - Nienaruszone chromosomy przygotowano w czopach agarozowych, oddzielono za pomocą CHEF, wybarwiono bromkiem etydyny i uwidoczniono w świetle UV. Pasy: jak wyżej.
(3) Plamy chromosomowe – Oddzielone chromosomy przeniesiono do nylonu i zhybrydyzowano z sondą HIS3 o znakowaniu ³²znakowanymi P o pojemności 1,8 kb w celu uwidocznienia następujących chromosomów: 1,1 Mb nienaruszony chromosom XV, 0,8 Mb chromosom translokacyjny tXV:III, 0,6 Mb chromosom translokacyjny tIII:XV i 0,3 Mb nienaruszony chromosom III. Pasy: Jak wyżej.

Dyskusja

Wysokie dawki promieniowania jonizującego stwarzają nieodłączne ryzyko niestabilności genomu poprzez wytwarzanie dużej liczby^{DSB 19}. Genomy eukariotyczne są pełne powtarzających się sekwencji, które są doskonałymi substratami do generowania translokacji i innych rearanżacji genomu^20,21. Translokacje chromosomowe przez HR są często obserwowane, gdy DSB są wprowadzane między powtarzającymi się sekwencjami^12,21,22. Przytłaczające dowody sugerują, że znaczna część niestabilności genomu związana z białaczkami i chłoniakami może być przypisana translokacjom chromosomowym, co podkreśla znaczenie zrozumienia, w jaki sposób ten mechanizm zachodzi u eukariontów^22,23. Opracowaliśmy system w pączkujących drożdżach do badania tworzenia chromosomów translokacyjnych przez HR indukowaną przez DSB między krótkimi regionami homologii na różnych chromosomach, które są podobne pod względem wielkości do powtarzających się elementów rozproszonych w genomach drożdży i ludzi.

W teście substrat translokacyjny his3-Δ3' znajduje się na jednej kopii chromosomu XV. Drugi allel his3 (his3-Δ200) ma ~1kb delecję promotora HIS3 i sekwencji kodującej, co uniemożliwia użycie tej sekwencji jako matrycy do naprawy²⁴. Substrat his3-Δ5' znajduje się w locus LEU2 na jednej kopii chromosomu III, a druga kopia chromosomu III zawiera niezmieniony allel LEU2 (ryc. 1). Indukowaną galaktozą kasetę ekspresji endonukleazy HO oznaczoną KAN-MX wprowadzono do locus TRP1 chromosomu IV (trp1::GAL-HO-KAN-MX). Każdy substrat translokacyjny jest otoczony sekwencją rozpoznającą endonukleazę HO, która może być ukierunkowana na rozszczepienie poprzez indukcję ekspresji genu HO poprzez dodanie galaktozy do pożywki. Po rozszczepieniu wywołanym przez endonukleazę HO na substratach his3-Δ3' i his3-Δ5' , komórki mogą efektywnie wykorzystać wspólny krótki odcinek homologii sekwencji HIS3 (311 pz lub 60 pz) do naprawy uszkodzonych chromosomów przez HR, generując chromosom translokacyjny z nienaruszonym allelem HIS3 ^12-14,25.

Ponieważ komórki rodzicielskie nie mają nienaruszonej kopii genu HIS3 , nie są w stanie rosnąć na pożywce. Tylko komórki, które przeszły zdarzenie translokacji, mogą być wybrane na pożywce pozbawionej histydyny. Dlatego częstość translokacji chromosomowych można obliczyć, dzieląc liczbę kolonii prototroficznych histydyny przez całkowitą liczbę żywotnych komórek platerowanych, określoną przez posiew na YPD. Genomowe DNA i nienaruszone chromosomy można następnie wyizolować z reprezentatywnych kolonii His⁺ , a obecność chromosomu translokacyjnego zweryfikować za pomocą genomowych analiz południowych i chromosomów blot.

Dokładna analiza pozwoliła nam zebrać dodatkowe ważne informacje na temat testu¹². Analiza genomiczna Southern blot dostarczyła dowodów na to, że po 30 minutach indukcji endonukleazy Ho dochodzi do praktycznie całkowitego przecięcia chromosomów XV i III, a zatem nie ma znaczącego tła dla niepociętych substratów chromosomowych w populacji (G. Manthey i A. Bailis, wyniki niepublikowane). Analizy genomu południowego i plam chromosomowych u osób, ^{które przeżyły} chorobę, wskazują, że komórki często tracą jeden, drugi lub oba chromosomy i pozostają żywotne (L. Liddell i A. Bailis, wyniki niepublikowane). Co ważne, prawie równoważna skuteczność posiewu na pożywce nieselektywnej przed i po indukcji ekspresji endonukleazy HO wskazuje, że ani niepowodzenie w naprawie uszkodzonych chromosomów, ani niepowodzenie w zachowaniu chromosomów translokacyjnych nie wpływa na zdolność do przetrwania tworzenia DSB. W związku z tym wykazano, że chromosom translokacji tXV:III jest niestabilny w komórkach mitotycznych przy braku selekcji. Wykazano to, hodując tXV::III zawierające rekombinanty His⁺ przez noc nieselektywnie, posiewając pojedyncze kolonie na nieselektywnych płytkach i replikując posiewy na selektywnym pożywce pozbawionej histydyny. Dziesięć do 70% kolonii powstałych na tych płytkach utraciło chromosom translokacji tXV::III (N. Pannunzio & A. Bailis, wyniki niepublikowane).

Chromosomy translokacyjne generowane przez ekspozycję na podczerwień u ludzi wykazują podobną niestabilność²⁶. Sugeruje to, że tworzenie translokacji może przyczyniać się do wczesnych zdarzeń w nowotworzeniu poprzez promowanie utraty heterozygotyczności. Po drugie, obszerne analizy genetyczne i molekularne sugerują, że SSA, skuteczny i obowiązkowo niekonserwatywny mechanizm HR, jest głównym mechanizmem tworzenia translokacji przez HR po jednoczesnym utworzeniu DSB na dwóch chromosomach^12,27,28. Jest to zgodne z odkryciem, że duże dawki IR skutkują gęstością DSB wystarczającą do tworzenia pęknięć sąsiadujących z wieloma powtarzającymi się sekwencjami w genomie drożdży oraz wysoką częstotliwością tworzenia translokacji przez HR. Łącznie obserwacje te sugerują, że onkogenny efekt ekspozycji na podczerwień u ludzi może częściowo wynikać z naprawy DSB przez wydajny mechanizm HR, który generuje translokacje, które poprzez swoją nieodłączną niestabilność sprzyjają zmianom genetycznym, które uruchamiają nowotworzenie . Ponieważ promieniowanie jest często stosowane w leczeniu raka, rearanżacje genomu, które wynikają z naprawy DSB wywołanych promieniowaniem, mogą przyczyniać się do powstawania wtórnych nowotworów, które często pojawiają się u pacjentów. W związku z tym model ten może pomóc nam lepiej zrozumieć genetyczne i molekularne podstawy ważnej odpowiedzi klinicznej na leczenie IR.