Barwienie immunohistochemiczne biomarkerów w skrawkach neurosfery guza mózgu

Streszczenie

Źródło: Núñez, F. J., et al. Ocena biomarkerów w glejaku za pomocą immunohistochemii na zatopionych w parafinie kulturach neurosfery glejaka 3D. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film przedstawia immunohistochemiczną technikę znakowania biomarkerów nowotworowych w neurosferach guza mózgu zanurzonych w parafinie. Skrawki neurosfery poddawane są usuwaniu parafiny i nawadnianiu, a następnie leczeniu w celu odsłonięcia miejsc biomarkerów. Następnie stosuje się przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe w celu znakowania tych biomarkerów. Przeciwciała drugorzędowe są wiązane przez enzymy peroksydazy sprzężonej z awidyną, które utleniają substraty chromogenne, aby wskazać lokalizacje biomarkerów. Na koniec kończy się barwienie przeciwjądrowe i przygotowanie szkiełek do analizy mikroskopowej.

Protokół

1. Immunohistochemia (IHC) neurosfer zatopionych w parafinie (NS)

1. Rozpuść parafinę, umieszczając szkiełka w metalowym stojaku i inkubując je w temperaturze 60 °C przez 20 minut.
2. Odparafinować szkiełka przez inkubację w pociągu do nawadniania w temperaturze pokojowej (RT): 3x ksylen przez 5 min, 100% 2x etanol przez 2 min, 95% 2x etanol przez 2 min, 70% 1x etanol przez 2 min, i 1x woda dejonizowana przez 2 min. W takim przypadku należy przechowywać szkiełka w wodzie z kranu do czasu pobrania antygenu, ponieważ wysuszenie spowoduje niespecyficzne wiązanie przeciwciał.
3. Inkubować szkiełka w buforze cytrynianowym (10 mM kwasu cytrynowego, 0,05% detergentu niejonowego, pH 6) w temperaturze 125 °C przez 30 s i w temperaturze 90 °C przez 10 s. Pozwól im ostygnąć, a następnie spłucz szkiełka 5 razy wodą destylowaną.
4. Inkubować szkiełka w RT w 0,3% H₂O₂ przez 30 minut.
5. Umyj szkiełka 3 razy w buforze myjącym (0,025% detergentu w soli fizjologicznej buforowanej Tris [TBS]) przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.
6. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym (10% surowica końska, 0,1% albumina surowicy bydlęcej [BSA] w TBS) przez 30 minut.
7. Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze z pierwszorzędowym przeciwciałem przygotowanym w roztworze rozcieńczającym (0,1% BSA w TBS). Umyć szkiełka 3 razy w buforze myjącym przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.
8. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z biotynylowanym przeciwciałem drugorzędowym przygotowanym w roztworze rozcieńczającym. Umyć szkiełka 3 razy w buforze myjącym przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.
9. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut z kompleksem peroksydazy chrzanowej i biotynylowanej. Umyć szkiełka 3 razy w buforze myjącym przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.
10. Inkubuj szkiełka z 3,3′-diaminobenzydyną (DAB)-H₂O₂ {{}} przez 2-5 minut w RT.
11. Spłucz 3 razy wodą z kranu. Zanurz (1-2 s) szkiełka w roztworze hematoksyliny, aby je zatamować, a następnie dokładnie spłucz je w wodzie z kranu, aż będą czyste.
12. Odwodnić szkiełka w następujący sposób: inkubować w wodzie destylowanej przez 2 minuty, zanurzyć 3 razy w 80% etanolu, inkubować w 95% etanolu 2 razy po 2 minuty, inkubować w 100% etanolu 2 razy po 2 minuty, a na koniec w ksylenie 3 razy po 3 minuty.
13. Nakryj szkiełka podstawowe medium montażowym na bazie ksylenu i pozwól im wyschnąć na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do obrazowania.

UWAGA: W przypadku barwienia DAB preparaty można przechowywać w temperaturze pokojowej. Jeśli jednak przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne, szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C, aby ograniczyć fotowybielanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Poliklonalny anty-ATRX królika,	Santa Cruz Biotechnology	sc-15408	IHC, 1:1:250 rozcieńczenie
Poliklonalny anty-Ki-67 królika	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 rozcieńczenie
Poliklonalny anty-OLIG2	Millipore	AB9610	IHC, rozcieńczenie 1:500
Koza poliklonalna anty-królicza biotyna sprzężona z biotyną	Dako	E0432	IHC, 1:1000 rozcieńczenia
Vectastain Elite ABC HRP kit	Vector Laboratories Inc	PK-6100
ZESTAW DO CHROMOGENU BETAZOID DAB{{TAG_ 61}}	Biocare medical	BDB2004 L/cena do 12/18