Przygotowanie osocza bogatopłytkowego z ludzkiej krwi obwodowej

Streszczenie

Ten film przedstawia przygotowanie wysokiej jakości osocza bogatopłytkowego (PRP) poprzez badanie przesiewowe liczby płytek krwi, pobieranie i odwirowywanie krwi oraz izolowanie płytek krwi. Ten PRP jest stosowany w zastosowaniach terapeutycznych do regeneracji i gojenia tkanek.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu ludzi i zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję rewizyjną.

1. Pobieranie próbek

1. Przeprowadzaj badania przesiewowe pacjentów za pomocą wstępnej morfologii krwi, aby wykluczyć małopłytkowość i ustalić wyjściową liczbę komórek. Aby to zrobić, użyj hemocytometru klasy klinicznej do zliczania komórek. Upewnij się, że liczba płytek krwi przekracza 150 000 komórek/μL.

2. Upewnij się, że pacjent jest dobrze nawodniony przed pobraniem próbki. Można to zapewnić poprzez oględziny języka, turgor skóry i pomiar ciśnienia krwi.

3. Pobrać 100 ml krwi żylnej obwodowej z żyły łokciowej pacjenta za pomocą strzykawek 2 x 50 ml wypełnionych 5 ml antykoagulantu kwasowo-cytrynianowo-dekstrozowo-adeninowego (ACDA) w stosunku 1:10. Przechyl zebrane strzykawki w celu prawidłowego wymieszania antykoagulantu, aby uniknąć krzepnięcia próbki krwi przed przejściem do następnego kroku.
   UWAGA: Powolne pobieranie krwi może skutkować nieodpowiednim wymieszaniem pobranej krwi z antykoagulantem i krzepnięciem; dlatego do pobierania krwi należy użyć kaniuli o wartości co najmniej 18G.

4. Przenieść 100 ml krwi w strzykawkach do 15 ml stożkowych probówek wirowych z dnem o pojemności 15 ml w każdej probówce.

2. Wirowanie i izolacja

1. Umieść probówki wirówkowe w wirówce stołowej klasy klinicznej utrzymywanej w temperaturze pokojowej w sterylnym środowisku i uruchom początkowe miękkie wirowanie z prędkością 100 x g przez 15 minut. Antykoagulowana krew rozdziela się na trzy warstwy, tj. czerwone krwinki na dole, osocze na górze i kożuchowy płaszcz pośrodku.

2. Odpipetować górną warstwę trójwarstwowej próbki w sterylny sposób za pomocą sterylnej igły rdzeniowej 18G i zebrać ją do oddzielnej stożkowej dolnej probówki wirówkowej. Na każde 10 ml pobranego osocza należy przypadać osobne probówki.
   UWAGA: Decyzja o włączeniu kożucha zależy od charakteru osocza bogatopłytkowego, które próbujemy wyizolować, co z kolei zależy od charakteru jego klinicznego zastosowania. Jeśli pożądanym produktem jest PRP ubogi w leukocyty, należy powstrzymać się od włączania warstwy kożuchowca, natomiast jeśli pożądanym produktem jest PRP bogaty w leukocyty, wówczas górna warstwa osocza wraz z kożuchem jest pipetowana do drugiej rundy wirowania.

3. Zebrane osocze w 15 ml probówkach wirówkowych z 10 ml osocza każda poddać wirowaniu z twardym wirowaniem przy 1600 x g przez 20 minut. Płytki krwi obecne w osadkach osocza na dnie probówki. Zebrać supernatant do osobnej probówki.

4. Odpipetować osad płytek krwi do strzykawki o pojemności 5 ml za pomocą sterylnej igły do rdzenia kręgowego o sile 18 G. Zbierz wszystkie probówki z granulkami do jednej strzykawki o pojemności 5 ml do aplikacji.

5. Po drugiej rundzie wirowania należy rozpuścić zebrany osad o objętości wystarczającej do użytku klinicznego z supernatantem w probówce wirówkowej.

3. Walidacja

1. Poddaj końcowy PRP przygotowany do zliczania komórek za pomocą hemacytometru klasy klinicznej w celu obliczenia liczby płytek krwi i obliczenia bezwzględnej liczby płytek krwi w PRP, gradientu stężenia płytek krwi osiągniętego powyżej wartości wyjściowej oraz skuteczności odzyskiwania płytek krwi protokołu przy użyciu następującego wzoru.
   Bezwzględna liczba płytek krwi = liczba płytek krwi PRP w μL x 1000 x objętość PRP w ml
   Gradient stężenia płytek krwi =
   Skuteczność odzyskiwania płytek krwi =
   Na przykład do przygotowania PRP stosuje się 100 ml krwi z wyjściową liczbą płytek krwi 200 000 / μL, i uzyskuje się 5 ml PRP z końcową liczbą płytek krwi 3 000 000 / μL. Powyższe parametry oblicza się w następujący sposób:
   Bezwzględna liczba płytek krwi = 3 000 000 x 1000 x 5 = 15 miliardów płytek krwi
   Gradient stężenia płytek krwi = 3 000 000 / 200 000 = 15
   Wydajność odzyskiwania płytek krwi = 3 000 000 x 1000 x 5 / 200 000 x 1000 x 100 = 75%

2. Zapewnij skuteczność odzyskiwania protokołu poprzez powtarzające się cykle. Zastosowany skuteczny protokół zapewnia gradient stężenia powyżej 5 razy więcej niż wartość bazowa przy >80% skuteczności odzyskiwania. W zależności od pożądanego wykorzystania objętości PRP, liczba płytek krwi, które muszą zostać dostarczone, może być odpowiednio miareczkowana.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Antykoagulant roztwór dekstrozy cytrynianu IP	Fresenius Kabi, Indie	ACDAIP/L/A/19/00
BD Quincke	Needle Becton Dickinson, Hiszpania	405125	18G
Strzykawka DISPOVAN 50ml	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, Indie
Strzykawka DISPOVAN 5ml	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, Indie
Rurka Spinwin Stożkowe dno	Tarsons, Indie	546021
Sysmex XN-350	Sysmex Inc., USA	XN 350
Wirówka kliniczna	REMI, Indie	R-8C	4x4 z odchylanym wirnikiem