Analiza ultrastrukturalna wycinka mózgu myszy z wykorzystaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Abstract

Źródło: Lutz, D., et.al. Ocena parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje przygotowanie i analizę za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wycinka mózgu szczeniaka myszy. Protokół rozpoczyna się od tkanki utrwalonej tetratlenkiem osmu w żywicy, a następnie precyzyjnego przycinania w celu wyizolowania obszaru zainteresowania i ultramikrotomii w celu wytworzenia półcienkich i ultracienkich skrawków, które są wizualizowane odpowiednio za pomocą mikroskopii świetlnej i TEM.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Wybór parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej do analizy ilościowej

1. Mapowanie obszaru zainteresowania
   1. Wybierz obszar zainteresowania (np. hipokamp lub móżdżek) i zlokalizuj obszar w atlasie sekcji, wybierając obraz z atlasu, który zawiera ten obszar.
   2. Naszkicuj granice obszaru zainteresowania na obrazie przekroju i znajdź/nałóż te obramowania obszarów na próbkę żywicy.
   3. Zaznacz granice obszaru zainteresowania (np. hipokampa lub móżdżku) na próbce żywicy za pomocą cienkiej igły (26 G, 1 cal).
   4. Podgrzej próbkę żywicy do 85 °C w piekarniku, aby zmiękczyć żywicę do przycinania lub, alternatywnie, użyj urządzenia do przycinania, cienkiego ostrza lub papieru ściernego.
   5. Wyciąć obszar zainteresowania z próbki żywicy za pomocą żyletki. Zamontuj próbkę na prętach mocujących ze szkła akrylowego o wymaganym kalibrze (np. o średnicy 8 mm i długości 1 cm) za pomocą kleju. Przyciąć zamontowaną próbkę do cięcia pół- i ultracienkiego.
   6. Przygotować półcienkie (0,75 μm) i ultracienkie (70 nm) odcinki przycinanego obszaru za pomocą ultramikrotomu: ustawić go na 1,5 mm/s dla grubości 0,75 μm i na 0,7 mm/s dla grubości 70 nm.
   7. Zebrać półcienkie skrawki na szklanych nośnikach i zabarwić je 1% błękitem toluidynowym w PBS (przez 4 minuty).
   8. Umyj sekcje kilka razy w wodzie dejonizowanej. Zbadaj zabarwione skrawki pod mikroskopem świetlnym za pomocą obiektywów 4x (NA 0,1 ∞/-), 10x (NA 0,22 ∞/0,17), 40x (NA 0,65 ∞/0,17) i 100x (NA 1,25 ∞/0,17).
   9. Zbieraj ultracienkie sekcje na siatkach niklowych. Poddaj sieci działaniu TEM przy napięciu 180 kV i powiększeniu 3,200x, 6,000x i/lub 8,000x.
2. Analiza TEM
   1. Wybierz parametry ultrastrukturalne interesujące Cię do ilościowej analizy TEM (np. bulony z pęcherzykami i mitochondriami lub zmielinizowane i niezmielinizowane aksony) i wykonaj obrazy TEM tych parametrów w powiększeniu 3,500x, 6,000x i/lub 8,000x.

Materials