Transmisyjne obrazowanie mikroskopowe elektronów endocytozy pęcherzyków synaptycznych w neuronach hipokampa myszy

Streszczenie

Źródło: Villarreal, S., et. al., Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia analizę endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa poprzez znakowanie peroksydazą chrzanową i mikroskopię elektronową.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

Mikroskopia elektronowa

1. Przygotuj roztwór stymulacyjny o wysokim K⁺ z HRP (peroksydaza chrzanowa) jako 31,5 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 90 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM glukozy, 2 mM MgCl₂, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 i 5 mg/ml HRP, a następnie dostosuj do pH 7,4 za pomocą 5 M NaOH.
   1. Stymuluj kulturę neuronów hipokampa roztworem stymulacyjnym o wysokiej zawartości 1,5 ml K⁺ w temperaturze pokojowej (określanej jako K⁺) przez dodanie 1,5 ml do każdej studzienki przez 90 s. W stanie spoczynku (określanym jako R) należy stosować to samo stężenie 5 mg/ml HRP przez 90 s, ale z normalnym roztworem soli fizjologicznej. W przypadku próbki regeneracyjnej należy zastosować roztwór stymulacyjny o wysokiej zawartości K⁺, tak jak w przypadku próbki K⁺, a następnie szybko przemyć i zastąpić normalną solą fizjologiczną i inkubować przez 10 minut.
2. Utrwalanie i barwienie
   
   1. Przygotować 0,1 M bufor kakodylanu Na, używając 21,4 g/l kakodylanu Na o pH 7,4. Utrwalić komórki 4% aldehydem glutarowym w buforze kakodylowym 0,1 M Na przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć trzykrotnie buforem kakodylowym 0,1 M Na przez 7 minut każdy.
   2. Przygotować roztwór diaminobenzydyny (DAB) składający się z 0,5 mg/ml DAB z 0,3% H₂O₂ w ddH₂O i przefiltrować filtrem 0,22 μm. Stosować 1,5 ml roztworu DAB przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć trzy razy 0,1 M buforem kakodylowym Na przez 7 minut każdy.
      UWAGA: DAB jest toksycznym i podejrzewanym czynnikiem rakotwórczym. Prosimy o używanie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.
      UWAGA: Etykietowanie za pomocą DAB następuje z powodu jego utleniania przez H₂O₂, katalizowane przez HRP. Niewielkie wzrosty składowych skutkują zwiększonym sygnałem w próbce. Zwiększenie stężenia HRP przyspiesza działanie katalizatora. Odpowiednio duże stężenia H₂O₂ pozwalają na wyniszczające reakcje uboczne z HRP, hamując efekt znakowania³². W niniejszej pracy stężenia tego systemu znakowania zostały wybrane w oparciu o aktualnie dostępne badania.
   3. Inkubować neurony z 1,5 ml 1% OsO₄ w buforze kakodylowym 0,1 M Na przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C po utrwaleniu. Przemyć trzykrotnie 1,5 ml buforu kakodylowego 0,1 M Na przez 7 minut każdy.
      UWAGA: Ze względu na toksyczność i reaktywność OsO₄, trzymanie próbki na lodzie w kapturze chemicznym jest w wielu przypadkach lepsze niż używanie lodówki do inkubacji.
   4. Przygotować 0,1 M bufor octanu sodu z 13,61 g/l octanu sodu i 11,43 ml/l lodowatego kwasu octowego o pH 5,0. Przemyć trzykrotnie 1,5 ml 0,1 M buforu octanowego o pH 5,0 przez 7 minut każdy i inkubować z 1,5 ml 1% octanu uranylu w 0,1 M buforze octanowym o pH 5,0 przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przemyć trzykrotnie 1,5 ml 0,1 M buforu octanowego przez 7 minut każdy.
      
3. Osadzanie w żywicy epoksydowej
   
   1. Odwodnić kulturę neuronów pojedynczymi 1,5 ml popłukiwania 50%, 70% i 90% etanolu, przez 7 minut w każdym, a następnie 3 płukania 1,5 ml 100% etanolu przez 7 minut każde w dygestorium.
   2. Wymieszaj 485 ml/l żywicy epoksydowej bisfenolu-A-(epichlorhydryny), 160 ml/l bezwodnika bursztynowego dodecenylu (DDSA), 340 ml/l bezwodnika metylo-5-norborneno-2,3-dikarboksylowego (NMA) i 15 ml/l 2,4,6-tris(dimetyloaminometylo)fenol (DMP-30), aby utworzyć żywicę epoksydową. Dokładnie wymieszaj, a następnie przechowuj w próżni, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Bardzo ważne jest usunięcie pęcherzyków powietrza z żywicy, zwłaszcza tych mniejszych niż widoczne gołym okiem, ponieważ mogą one powodować ubytki w żywicy podczas cięcia.
   3. Infiltrować próbkę, zastępując etanol 50% żywicą epoksydową w etanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce, a następnie 70% żywicą epoksydową w etanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
   4. Zamiana roztworu żywicy epoksydowej na 100% żywicę epoksydową i inkubować przez 10 minut w temperaturze 50 °C. Przeprowadzić dwie wymiany świeżej 100% żywicy epoksydowej z inkubacją przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C. Dodać świeżą 100% żywicę epoksydową i pozostawić do stwardnienia w temperaturze 50 °C przez noc, a następnie w temperaturze 60 °C przez ponad 36 godzin w celu stwardnienia.
4. Wyjmij każdą próbkę z płytki muti-well za pomocą piły ręcznej jubilera. Wybierz obszary zainteresowania, gęste stężenia komórek, używając mikroskopu światła odwróconego, a następnie wytnij bloki o długości od 70 do 80 nm do przekroju za pomocą mikrotomu. Zamontuj wycięty obszar w uchwycie do mikrotomów i załaduj mikrotom. Umieść uchwyt w mikrotomie i zamontuj nóż diamentowy tak, aby krawędź była równoległa do powierzchni bloku. Zbieraj skrawki o grubości od 70 do 80 nm bezpośrednio na poszczególne siatki.
5. Rozpuścić octan uranylu w wodzie, aby uzyskać 1% roztwór wagowy, i oddzielnie rozpuścić cytrynian ołowiu w wodzie, aby uzyskać 3% roztwór wagowy. Przeciwbarwić skrawki przez zanurzenie 1% wodnym octanem uranylu przez 15 minut, a następnie 3% wodnym roztworem cytrynianu ołowiu przez 5 minut, aby poprawić kontrast próbek.
6. Obrazowanie EM
   1. Zbadaj przekroje za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego i zapisz obrazy za pomocą kamery cyfrowej CCD przy pierwotnym powiększeniu 10 000-20 000X.

Materiały