Wsteczne znakowanie neuronów ruchowych Drosophila za pomocą fluorescencyjnych barwników lipofilowych

Streszczenie

Źródło: Inal, M. A. et. al., wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila przy użyciu lipofilowych barwników fluorescencyjnych. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film pokazuje metodę wstecznego znakowania neuronów ruchowych Drosophila za pomocą barwników lipofilowych. Barwnik dostaje się do aksonu, przemieszcza się wstecz i oznacza neurony na zielono, umożliwiając szczegółową wizualizację ich morfologii i projekcji pod mikroskopem konfokalnym.

Protokół

1. Sprzęt i zaopatrzenie

1. Materiały do pobierania zarodków i szkolenia dorosłych do składania jaj
   1. Przygotuj aparat filtracyjny, przecinając probówkę o pojemności 50 ml i wycinając otwór w nasadce, aby umieścić filtr siatkowy z porami 100 μm (Tabela materiałów) między rurką a Czapka.
      UWAGA: Alternatywnie, sitka komórkowe z porami 100 μm (Tabela materiałów) mogą być używane do etapu filtracji pobierania zarodków.
   2. Wykonaj płytki agarowe z premiksem agaru winogronowego (Tabela materiałów) zgodnie z podanymi instrukcjami. Krótko delikatnie wymieszać jedno opakowanie mieszanki proszkowej z 500 ml wody destylowanej o temperaturze pokojowej (RT, 23 °C) (dH₂O) i podgrzać rozpuszczoną mieszaninę w kuchence mikrofalowej do energicznego wrzenia. Po schłodzeniu do temperatury 70−75 °C mieszaninę rozlać na szalki Petriego (60 mm). Po zestaleniu się agaru przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.
   3. Przygotować pastę drożdżową, mieszając aktywne suche drożdże (Tabela materiałów) i wodę do konsystencji pasty i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   4. Stosować klatki do zbierania jaj (na szalkę Petriego o średnicy 60 mm, Tabela materiałów), które zapewniają wystarczający przepływ powietrza.
      
2. Przygotowanie igieł preparacyjnych i mikropipet do iniekcji barwnika
   1. Przygotuj mikropipetę do iniekcji barwnika i igłę do preparowania z tej samej rurki kapilarnej o średnicy wewnętrznej 0,6 mm i średnicy zewnętrznej 1,2 mm (Tabela materiałów). Pociągnij rurkę kapilarną za pomocą ściągacza do mikropipet pod kątem 7% od maksymalnej mocy wyjściowej 170 V (Tabela materiałów), aby utworzyć ostrą igłę o stożku o długości ~0,4 cm.
   2. W przypadku wstrzykiwania barwnika należy wyregulować mikropipetę za pomocą mikropipety ze skosem (Tabela materiałów) techniką ukosowania pęcherzykowego opisaną w instrukcji obsługi urządzenia.
      1. Krótko mówiąc, namocz młynek środkiem zwilżającym (Tabela materiałów), aby zapobiec "ciągnięciu" końcówki igły przez wodę. Umieść igłę na zacisku mikropipety pod kątem 25−30° i opuść końcówkę na dwie trzecie promienia od środka powierzchni ukosowania. Zmielić igłę, podczas gdy strzykawka z rurką wpycha powietrze do igły, aby upewnić się, że mikropipeta będzie wolna od wiórów szklanych.
      2. Oznacz mikropipetę markerem permanentnym z cienką końcówką, aby wskazać położenie otworu na końcówce po ukosowaniu, ponieważ trudno jest zlokalizować wąski otwór mikropipety, który jest uformowany pod kątem.

2. Przygotowanie do pobrania zarodków

1. Upewnij się, że dorosłe muchy (20−40 much typu dzikiego Canton-S lub white), samce i samice, są utrzymywane w młodych (<7 dni) i zdrowych warunkach do idealnego pobrania jaj.
   UWAGA: Aby stymulować składanie jaj, muchy są szkolone w klatce do zbierania jaj na kilka dni przed pobraniem jaj na płytkach agarowych posmarowanych pastą drożdżową co najmniej raz dziennie.

3. Ocena zarodka

1. Pozwól muszkom złożyć jaja przez noc (lub co najmniej 15 godzin) w RT, aby zebrać zarodki po 15 godzinach od złożenia jaj (AEL), tj. stadium 16, aby zobaczyć dendrytogenezę neuronów ruchowych przedniej komórki narożnika (aCC) i surowej krewetki 3 (RP3). Rano zbierz talerz z jajkami.
   UWAGA: Zarodki po 15 godzinach AEL będą miały wyraźne 4-komorowe jelito. W przypadku obrazowania różne etapy należy kierować się ich specyficznymi kryteriami morfologicznymi i warunkami starzenia.
2. Aby zebrać zarodki, należy zdechorionować jaja złożone na płytce za pomocą 50% wybielacza przez 5 minut.
3. Gdy kosmówka zostanie oczyszczona, przelej zawartość płytki przez aparat filtracyjny lub sitko do komórek, aby wyizolować zarodki. Używając wyciśniętej butelki z wodą, rozcieńczyć wybielacz pozostały na płytce i zebrać jak najwięcej zarodków, dekantując mieszaninę do filtra.
4. Umyj zarodki na filtrze 3−4x większą ilością wody lub do momentu, gdy zapach wybielacza zniknie. Wyjmij filtr z aparatu i umyj zarodki na innej czystej płytce z wodą. Zdekantować wodę z nowej płytki, na której znajdują się zarodki.
5. Przygotuj szklane szkiełko, przykrywając je dwiema warstwami taśmy winylowej pośrodku, tworząc prostokąt. Wytnij prostokątną kałużę z taśmy za pomocą żyletki. Umieść cienki pasek dwustronnej taśmy w kierunku górnego końca basenu, to jest miejsce, w którym zostaną umieszczone zarodki, jak pokazano na Rysunek 1.
6. Za pomocą cienkich kleszczy wybierz indywidualnie 5-10 zarodków po 15 godzinach AEL i umieść je na taśmie dwustronnej stroną grzbietową skierowaną do góry. Dodaj sól fizjologiczną Ringera z owadów do puli rozwarstwiającej, aby chronić zarodki przed wysuszeniem (Rysunek 1).

4. Preparacja i barwienie

1. Za pomocą szklanej igły pod mikroskopem preparacyjnym (Tabela materiałów), przetnij linię środkową pojedynczego zarodka na jego powierzchni od tylnego do przedniego końca. Następnie przeciągnij zarodek z błony witelinowej z taśmy na szkło (zapakowane w Rysunek 1). Uważaj, aby nie uszkodzić wewnętrznych tkanek zarodka.
2. Odwróć tkanki nabłonkowe od środka i przymocuj krawędź naskórka do powierzchni szkiełka (Rysunek 1, wstawka).
3. Za pomocą igły połączonej z rurką z otworem końcówki ~300 μm (przygotowanej przez złamanie cienkiej końcówki igły preparcyjnej), zassaj lub przedmuchnij powietrze, aby odłączyć i usunąć grzbietowe podłużne pnie tchawicy, a także wszelkie pozostałe jelita.
4. Użyj 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby utrwalić zarodki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj zarodki 3x PBS.
5. Zarodki należy wybarwić 1 μl przeciwciała przeciwko peroksydazie chrzanowej sprzężonego z barwnikiem cyjaniny3 (anty-HRP Cy3) (Tabela materiałów) w 200 μl PBS przez 1 godzinę. Po barwieniu umyj zarodki PBS 3x.
   UWAGA: Barwnik anty-HRP można zmienić w oparciu o wybrane barwniki lipofilowe do wstrzykiwań.

5. Napełnianie mikropipety iniekcyjnej

1. Termiczne barwniki lipofilowe (5 mg/ml 3,3'-dioktadecyloksakarbocyjaniny, nadchloranu (DiO) lub 1,1′-dioctadecylo-3,3,3′,3′-tetrametylolindodikarbocyjaniny, soli 4-chlorobenzenosulfonianu (DiD), Tabela materiałów) do 60 °C w mieszaninie etanolu w stosunku 1:10: olej roślinny przed użyciem.
2. Przygotować rozpuszczony w oleju szkiełko barwnikowe do mikropipety iniekcyjnej. Umieść mikropipetę w uchwycie kapilarnym (Rysunek 2, #1). Za pomocą mikromanipulatora (Tabela materiałów), ustaw mikropipetę tak, aby znajdowała się nad szkiełkiem barwnika. Następnie wyreguluj stolik, aby umieścić mikropipetę na barwniku (Rysunek 2, #2).
3. Aby napełnić mikropipetę, użyj mikrowtryskiwacza (Tabela materiałów) (Rysunek 2, #3). Zebrać barwnik w mikropipecie, ustawiając P_i (ciśnienie wtrysku) między 200−500 hPa (hektopaskal), T_i (czas wtrysku) między 0,1−0,5 s a P_c (ciśnienie kompensacyjne) na 0 hPa na 5 min (Rysunek 2, #4).
4. Po zebraniu barwnika usuń szkiełko barwnikowe i umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Następnie zwiększ Pc do zakresu 20−60 hPa przed opuszczeniem mikropipety do próbki, aby zapobiec zanieczyszczeniu PBS przez działanie kapilarne.

6. Wstrzyknięcie barwnika do neuronów

1. Zlokalizuj zarodek w środku za pomocą mikroskopu z soczewką obiektywową 10x (Tabela materiałów) i wyrównaj mikropipetę z zarodkiem.
   UWAGA: Wielkość kropli barwnika można regulować, zmieniając liczbę Pi lub rozmiar otworu końcówki mikropipety. Kropla powinna mieć 10−20 μm, co odpowiada w przybliżeniu szerokości 1 mięśnia.
2. Zmień soczewkę obiektywu na soczewkę zanurzeniową w wodzie 40x (Tabela materiałów) i zanurz soczewkę w PBS, aby zobaczyć zarodek.
   1. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby sprawdzić morfologię neuronów oznaczoną przez anty-HRP Cy3 i określić miejsce wstrzyknięcia.
   2. Podczas wstrzykiwania należy użyć mikroskopii w jasnym polu, aby zobaczyć kroplę barwnika. Gdy zarodek jest w ostrości, zmień położenie mikropipety, aby delikatnie zetknąć się z końcówką aksonu będącego przedmiotem zainteresowania (np. aCC, RP3).
   3. Upuść barwnik w półsegmencie prawej części brzucha (A2−A6) w połączeniu nerwowo-mięśniowym aCC lub RP3 (Figura 3) z DiD lub DiO, używając neuronów oznaczonych anty-HRP Cy3. Korzystanie z pilota (mysz; Rysunek 2, 5) uwolnić barwnik i wyjąć mikropipetę po upuszczeniu barwnika za pomocą mikromanipulatora i przejść do następnego miejsca wstrzyknięcia.
      UWAGA: W przeciwieństwie do innych barwników (np. żółcień Lucyfera, kalceina), które rozprzestrzeniają się do sąsiednich komórek przez połączenia szczelinowe, barwniki lipofilowe łączą się z błonami komórkowymi i nie przenoszą się na sąsiadów. Jednak ze względu na stosunkowo duży rozmiar kropelki barwnika, technika ta powoduje również znakowanie mięśni partnerskich (Rysunek 3A).
3. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę po upuszczeniu barwnika przed obrazowaniem.
   UWAGA: Protokół może być tutaj wstrzymany przed montażem, a próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez noc. Barwniki lipofilowe mogą być również dostarczane za pomocą jonoforezy, jeśli wewnątrzkomórkowy wzmacniacz sprzężony bezpośrednio (DC) jest łatwo dostępny.

7. Obrazowanie za pomocą mikroskopu konfokalnego

1. Usuń taśmę dwustronną i taśmę winylową ze szkiełka za pomocą kleszczy.
2. Przygotuj szkiełko nakrywkowe (szkło nakrywkowe 22 x 22 mm2 nr 1) z niewielką ilością smaru próżniowego (Tabela materiałów) w czterech rogach i ostrożnie umieść na próbce, unikając pęcherzyków powietrza. Usuń nadmiar PBS za pomocą wycieraczek zadań.
3. Dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby wyregulować odległość roboczą między soczewką obiektywu a próbką. Całkowicie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.
4. Obraz w powiększeniu 10x i 100x za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja basenu preparacyjnego. Niebieska komora widoczna na szklanym szkiełku jest wykonana z taśmy winylowej utrzymującej bufory w środku. Taśma dwustronna przytrzymuje zarodki, które są prawidłowo wyrównane. ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x obiektyw lens<
40x soczewka zanurzeniowa w wodzie	Nikon		NIR Apo
rurka kapilarna	Frederick Haer&Co	27-31-1
Mikroskop konfokalny	Andor	N/A	Dragonfly Wirujący dysk jednostka konfokalna
Cover glass	Corning		22x22 mm Square #1
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Mikroskop preparacyjny	Nikon	N/A	SMZ-U
Taśma dwustronna	Scotch	665
Dow corning smar wysokopróżniowy	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Kleszcze	Fine Science Tools	11252-20
Egg collection cage	FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	wycofane	FemtoJet 4i (nr kat. 5252000021)
Micromanipulator	Sutter	MP-225
Ukosowarka do mikropipet	Sutter	BV-10-B
Ściągacz do igieł	Narishige	PC-100
Pakiety premiksów z agarem winogronowym Nutri-fly	FlyStuff	47-102
Nylon net filter	Millipore
Paraformaldehyd 16% roztwór, klasa EM	Nauki o mikroskopii elektronowej	15710	Any EM grades
PBS	Roche	11666789001	Sprzedawane na sigmaaldrich, pudełkowe rozwiązanie 10x
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Środek zwilżający
Pionowy mikroskop fluorescencyjny	Nikon	N/A	Eclipse Ci ze źródłem
Taśma izolacyjna winylowa	Scotch	6143
VWR Cell sits	VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Aktywne suche drożdże (RED STAR)

td style='kolor tła:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>NikonPlan światła LED