Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek nerwowych zróżnicowanych z obwodowych komórek krwiopochodnych

Streszczenie

Źródło: Becker-Kojić, Z. A., i inni. al., Wolne od GMO pokolenie komórek neuronalnych pochodzących z krwi. J. Vis. Exp. (2021)

Film przedstawia protokół przygotowania komórek nerwowych pochodzących z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej do mikroskopii fluorescencyjnej, prezentując różne typy komórek i etapy rozwoju za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego.

Protokół

1. Analiza mikroskopii immunofluorescencyjnej komórek nerwowych pochodzących z krwi
   1. Hoduj komórki przez 16 dni i usuń pożywkę.
      1. Inkubować z podgrzanym utrwalaczem składającym się z 75 ml sterylnej wody, 4 g paraformaldehydu. W razie potrzeby dodać 10 N NaOH i mieszać, aż roztwór się klaruje. Następnie dodaj 10 ml 10x PBS, 0,5 ml MgCl₂, 2 ml 0,5 M EGTA i 4 g sacharozy. Miareczkować do pH 7,4 za pomocą 6 N HCl i doprowadzać do 100 ml sterylnej wody przez 15 minut.
      2. Odrzuć utrwalacz i myj komórki 3 razy przez 5 minut za każdym razem. Natychmiast dodaj świeżo przygotowany 0,3% roztwór Triton X i przepuszczaj komórki przez 5 minut. Umyj 3 razy PBS i dodaj roztwór blokujący wykonany z PBS i 5% BSA.
      3. Zablokuj komórki w temperaturze pokojowej na płycie kołyskowej na 1 godzinę.
      4. Przygotować odpowiednie rozcieńczenia przeciwciał w 1% BSA/PBS i inkubować komórki z rozcieńczeniami przeciwciał na płytce kołyskowej przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki 3 razy PBS przez 5 minut każda, inkubować komórki za pomocą DAPI i zamontować szkiełka nakrywkowe z mediami montażowymi w celu wizualizacji pod mikroskopem.
         UWAGA: Bezpośrednio znakowane przeciwciała użyte w tym eksperymencie są wymienione w Tabeli materiałów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koniugat anty-GFAP Cy3	Merck Millipore	MAB3402C3
Anty-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterylne	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML