Analiza struktur amyloidowych w skrawku tkanki przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Streszczenie

Źródło: Nyström, S., et al., Obrazowanie tkanek amyloidowych wybarwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film przedstawia analizę struktur amyloidowych za pomocą mikroskopii obrazowania fluorescencji (FLIM), przy użyciu barwnika hFTAA w celu ujawnienia zwartych rdzeni jako niebieskich/zielonych i niestabilnych peryferii jako czerwonych/żółtych na obrazach oznaczonych kolorami, odzwierciedlających organizację amyloidu.

Protokół

1. Przygotowanie próbek tkanek

UWAGA: Wiele typów tkanek można obrazować przy użyciu kwasu heptamerowo-formylowo-tiofenowego (hFTAA) jako markera amyloidu. hFTAA jest wrażliwy na konformację agregatów. W związku z tym barwienie powinno być najlepiej wykonywane na niezakłóconych kruszywach bez ekspozycji epitopów. Optymalna jakość widmowa jest osiągana, jeśli utrwalenie tkanki jest ograniczone do minimum. Dlatego preferowany jest świeżo zamrożony materiał, delikatnie utrwalony w etanolu w czasie barwienia. Możliwe jest jednak wykrycie złogów amyloidu również w tkance, która została utrwalona za pomocą np. , formaliny. hFTAA na ogół dobrze przenika do tkanki. Wybierz grubość próbki, która jest zgodna z zamierzoną techniką obrazowania.

1. W przypadku stosowania odcinków utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, należy je odparafinować w ksylenie przez noc. Następnie zanurz sekcje w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu, dH₂O i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), po 10 minut w każdej. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia w warunkach otoczenia.
   Uwaga: Ksylen jest zawsze przenoszony w dygestorium chemicznym. Ksylen i inne rozpuszczalniki organiczne są szkodliwe.
   1. Rozmrozić kriosekcje w temperaturze pokojowej. Utrwal skrawki tkanki w 10% formalinie przez noc i nawodnij je, zanurzając je w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu, dH₂O i PBS, po 10 minut w każdym. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia w warunkach otoczenia.
2. Dodać kropelki roztworu roboczego hFTAA (około 200 μl) do skrawków tkanki, aby ją przykryć. Kropla powinna pozostać na miejscu dzięki napięciu powierzchniowemu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu barwienia.
3. Spłukać roztwór barwiący 500 μl PBS za pomocą pipety, a następnie zanurzyć szkiełko w kąpieli PBS na 10 minut. Pozostaw sekcję do wyschnięcia w warunkach otoczenia.
4. Zamontuj za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Pozostawić medium montażowe na noc.

2. FLIM
UWAGA: Mikroskop konfokalny jest wyposażony w jednostkę do obrazowania fluorescencji w czasie życia (FLIM).

1. Ustaw następujące parametry mikroskopu konfokalnego: Otworek, 20; długość fali wzbudzenia, 490 nm; natężenie lasera, 0,5% (co odpowiada średniej mocy 7,5 μW). Użyj laserów impulsowych na częstotliwości 40 MHz.

2. W oprogramowaniu FLIM ustaw zliczanie fotonów powyżej 550 nm. W oknie Parametry wyświetlania postępuj zgodnie ze zliczaniem fotonów, aż maksymalna liczba fotonów wyniesie około 4 000 zliczeń.

3. Zapisz plik i wyeksportuj go jako obraz zliczający pojedyncze fotony (SPC).

4. Dopasuj dane do 2-składnikowego rozkładu wykładniczego w oprogramowaniu FLIM. Dopasowanie, które daje χ² < 2 jest dobre. Wartość na osi y to liczba zliczeń dla danego okresu istnienia.

5. Wybierz próg, który ma być uwzględniany przez liczby, e.g., 100. Oznacz kolorem według T1 i wybierz zakres żywotności. Rozpad jest zależny od struktury amyloidu, w której związany jest hFTAA. Zaobserwowano czas życia fluorescencji od 300 do 1000 ps. Zapisz plik.

6. Wyeksportuj surowe dane za pomocą opcji eksportu i zapisz żądane dane w nowym folderze.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako Średni montaż fluorescencji	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
System Spectraview	Obrazowanie spektralne ASI
Oprogramowanie Spectraview	Obrazowanie spektralne ASI
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 software	Zeiss
system FLIM	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
Przestrajalny laser w stroju	Zeiss