$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1.Live Nagrywanie obrazu
- Przygotowanie komórek do obrazowania na żywo
1. Hodowla komórek neuronów podwzgórza WT i CCR5-/- wyrażających zielone białko fluorescencyjne znakowane transporterem glukozy 4 (GFP-GLUT4) na szklanym szkiełku nakrywkowym o grubości #1,5 (lub 0,17 mm), które zostało wstępnie pokryte poli-D-lizyną w płytce 6-dołkowej.
2. Ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z neuronami za pomocą kleszczy i ostrożnie umieść je na szkiełkach podstawowych.
3. Usuń nadmiar podłoża/płynu za pomocą delikatnych chusteczek do zadań. Złóż chusteczki dwukrotnie i ostrożnie umieść je na szkiełku nakrywkowym. Delikatnie dociśnij chusteczki bez przesuwania szkiełka nakrywkowego.
UWAGA: Nie dociskaj szkiełka nakrywkowego na siłę do szkiełka podstawowego. Celem tego etapu jest upewnienie się, że szkiełko nakrywkowe nie przesuwa się/nie dryfuje podczas akwizycji obrazu spowodowanej siłą wyporu.
4. Umieść szkiełka nakrywkowe i szkiełka podstawowe na stoliku mikroskopu dekonwolucyjnego, szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w dół i odpowiednio zabezpieczonym. Ten krok ma na celu zapewnienie, że pozycja slajdu pozostaje stała, aby użytkownicy mogli później śledzić ten sam zestaw komórek docelowych.
5. Obserwuj komórki neuronów podwzgórza WT i CCR5-/- za pomocą soczewki obiektywowej zanurzonej w oleju 60x/1,42 NA.
6. Traktuj wybrane próbki komórek CCL5 (10 ng / ml) lub insuliną (10 U / ml) przez jedną minutę. Dodaj 1,5 μl rozcieńczonej insuliny na krawędź szkiełka nakrywkowego.
7. Natychmiast wizualizuj i rejestruj wybrane próbki komórek. Zaprogramuj oprogramowanie do nagrywania wideo tak, aby nagrywało przez 30 minut.
2. Mikroskopia dekonwolucyjna i analiza
UWAGA: Ta część protokołu wymaga użycia mikroskopu dekonwolucyjnego i specjalistycznego oprogramowania do analizy.
1. Włącz zasilanie systemu obrazowania, poczekaj, aż stage mikroskopu rozpocznie się prawidłowo, a następnie włącz źródło światła LED.
2. Dodaj olejek immersyjny (współczynnik załamania światła 1,520 dla żywych próbek w temperaturze 37 °C) na soczewkę obiektywu 60x 1,42 NA. Umieść szkiełko z próbką na mikroskopie ze szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę soczewki obiektywu i odpowiednio zabezpiecz szkiełko.
3. Użyj jasnego pola lub oświetlenia fluorescencyjnego, aby zidentyfikować komórki docelowe. Dostosuj ostrość, aż będzie można wyraźnie obserwować komórki docelowe. Nie przesuwaj soczewki obiektywu poza obszar szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć niepotrzebnych zadrapań.
4. Zidentyfikuj transporter glukozy 4 sprzężony z białkiem zielonej fluorescencji (GFP-GLUT4) za pomocą sygnału GFP. Zidentyfikuj żądane komórki docelowe do akwizycji obrazu. Wybrana pozycja komórki docelowej może zostać zapamiętana do wykorzystania w przyszłości (patrz Rysunek 1).
5. Ustaw odpowiednie parametry eksperymentalne (w tym liczbę pikseli, długość fali wzbudzenia, procent transmisji, czas ekspozycji, grubość stosu, przedział czasowy i całkowity czas obrazowania) na każdej komórce docelowej. W tym eksperymencie numer piksela obrazu został ustawiony na 512 x 512 (można go ustawić na 1 024 x 1 024 w celu uzyskania wyższej rozdzielczości) dla sygnałów GFP. Czas naświetlania został ustawiony w zakresie od 0,025 do 0,05 s na każde 5 minut. Drobne boczne korekty x, y i z mogą być kontrolowane przez zalecane oprogramowanie (patrz Tabela materiałów).
6. Ustaw parametr ekspozycji na około 2,000 do 3,000 zliczeń, aby osiągnąć maksymalną intensywność pikseli. Aby zminimalizować fotowybielanie fluorescencyjne, zmniejsz procent transmisji światła wzbudzającego tak bardzo, jak to możliwe, utrzymując czas ekspozycji krótszy niż 1 s. Powtórz te kroki dla każdego dodatkowego kanału fluorescencyjnego (kanałów) fluorescencji i każdego indywidualnego obszaru zainteresowania.
7. Ustaw górny i dolny limit stosu Z w każdej komórce docelowej. Można to osiągnąć, przesuwając stolik mikroskopu, aż górna i dolna część komórki docelowej będą nieznacznie nieostre. Użytkownicy mogą dostosować rozdzielczość osi Z, ustawiając liczbę obrazów między górnym a dolnym limitem (można to zrobić, ustawiając odległość między każdym obrazem).
8. Stosy obrazów zostały zdekonwolucjonowane, a następnie przeanalizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania – w tym przypadku Velocity firmy PerkinElmer.
