Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Abstract

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu oceny architektury synaptycznej poprzez ich kolokalizację.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etyki zwierząt.

1. Przygotowanie ostrego plastra hipokampa

Usuń mózg myszy tak szybko, jak to możliwe, używając szpatułki i ostrych nożyczek, aby przeciąć czaszkę, i umieść go w lodowatym, natlenionym (95% O₂, 5% CO₂), sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym o wysokiej zawartości sacharozy (ACSF, ~100 mL).

2. Umieść mózg myszy na szalce Petriego i usuń móżdżek oraz mały fragment kory czołowej za pomocą skalpela, zanim przejdziesz przez linię środkową mózgu.
3. Umieść dwie półkule po stronie, która właśnie została wycięta i przyklej każdą półkulę do sceny wibratomu.
4. Wytnij odcinki o grubości 200 - 300 μm całego obszaru zainteresowania. W przypadku hipokampa należy uzyskać około 3 - 4 plastry na półkulę.
5. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś plastry do komory zanurzonej w natlenionym (95%_O2, 5% CO₂) ACSF. Utrzymywać w temperaturze 34 °C przez 30 min.
   UWAGA: Na tym etapie plastry mogą być traktowane aktywnymi środkami farmakologicznymi, takimi jak rekombinowane białka Dickkopf-1 (Dkk1), dodając środki do komory plastrów.
6. Za pomocą pędzla wyjmij plastry z komory, umieść je na 24-dołkowej płytce i utrwal je przez 20 minut do 1 godziny w 4% paraformaldehydzie (PFA)/4% sacharozie w temperaturze pokojowej (RT).
   Uwaga: PFA jest toksyczny, należy nosić odpowiednią ochronę.
7. Umyj plastry trzy razy w 1X buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS, 10 min każdy).
   UWAGA: Protokół można tutaj wstrzymać na 1 - 2 dni, o ile plastry są przechowywane w temperaturze 4 °C w 1X PBS.

2. Immunofluorescencja markerów synaptycznych

UWAGA: Receptury wszystkich użytych buforów można znaleźć w Tabeli 1.

1. W dołkach kropelkowych zastąp PBS buforem blokującym/przepuszczalnym (Tabela 1) i inkubuj w temperaturze RT przez 4 - 6 godzin.
2. Rozcieńczyć poliklonalne przeciwciało świnki morskiej przeciwko pęcherzykowatemu transporterowi glutaminianu 1 (vGlut1) w rozcieńczeniu 1:2,000 w buforze blokującym/przepuszczalnym.
   UWAGA: vGlut1 jest markerem do wizualizacji presynaptycznego końca pobudzającego. Do identyfikacji postsynaptycznej synapsy pobudzającej należy użyć przeciwciała poliklonalnego przeciwko gęstości postsynaptycznej-95 (PSD-95) i rozcieńczyć 1:500 w tym samym roztworze. Użyć minimalnej objętości 300 μl w każdym dołku. Aby zidentyfikować anatomiczną lokalizację hipokampa, użyj przeciwciała, które może również zidentyfikować strukturę neuronalną, takiego jak białko związane z mikrotubulami 2 (MAP2) lub tubulina. Opracuj prawidłowe stężenia wszystkich pierwszorzędowych przeciwciał dla wybranych markerów synaptycznych (pre- i postsynaptycznych) i rozcieńcz w świeżym buforze blokującym/przepuszczalnym.
3. Inkubować plastry w roztworze przeciwciała przez noc (lub przez 1 - 2 dni) w temperaturze 4 °C. Energicznym ruchem należy używać platformy do wytrząsania.
4. Umyj plastry trzy razy w PBS (10 min każdy).
5. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:500 w buforze blokującym. Na przykład, używając przeciwciała świnki morskiej vGlut1, należy zastosować przeciwciało drugorzędowe, które rozpoznaje składnik świnki morskiej (np. anty-świnka morska osła) sprzężony ze specyficznym fluoroforem. W przypadku stosowania przeciwciała królika PSD-95 należy zastosować przeciwciało drugorzędowe, które rozpoznaje składnik królika (np. anty-królik osła) sprzężony z innym specyficznym fluoroforem.
6. Inkubuj plastry w tym roztworze przez 2 - 3 godziny w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że plastry są chronione przed światłem, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło.
7. Umyj plastry trzy razy w PBS (10 min każdy).
8. Ostrożnie usuń plastry z 24-dołkowej płytki za pomocą pędzla i ułóż je równomiernie na wstępnie oznaczonych szkiełkach. Dodaj kroplę podłoża montażowego na wierzch każdego plasterka, a następnie delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu plastrów. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. Należy pamiętać, aby użyć wystarczającej ilości podłoża montażowego (300-400 μL), ponieważ niewystarczająca ilość może prowadzić do wysuszenia plastrów.
9. Pozostaw do wyschnięcia na minimum 1 - 2 dni w temperaturze RT i chroń slajdy przed światłem.
10. Przechowuj slajdy w temperaturze 4 °C przez krótki czas, ale w przypadku długoterminowego przechowywania, utrzymuj je w temperaturze -20 °C.

3. Konfokalne pozyskiwanie i analiza

1. obrazuObrazowanie za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.
   1. Zidentyfikuj obszar hipokampa, który ma być zobrazowany (np. rogówkę amonisową 1 i 3 (CA1, CA3) lub zakręt zębaty (DG)) za pomocą obiektywu 10x lub 20x.
   2. Zmień na 40-krotny lub 63-krotny cel zanurzenia w olejku, aby upewnić się, że anatomia plastra jest nienaruszona, identyfikując ciągłe neuryty i zorganizowaną strukturę. Użyj markera neuronalnego, takiego jak MAP2, jako odniesienia (Figura 1A).
   3. Następnie przełącz się na obiektyw z 60-krotnym zanurzeniem w oleju (apertura numeryczna [NA] = ~1,3 - 1,4) i dostosuj ustawienia dla każdego kanału, aby uzyskać optymalny sygnał i kontrast. Użyj opcji wysokiego/niskiego kontrastu, aby ustawić intensywność każdego lasera, aby uniknąć nasycenia jakichkolwiek pikseli.
      UWAGA: Te ustawienia będą zależeć od użytego mikroskopu, ale zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat ustawień mocy lasera. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli. Ustawienia powinny pozostać niezmienne w różnych warunkach tego samego eksperymentu. W razie potrzeby można zastosować dodatkowe powiększenie.
   4. Oceń głębokość, na której barwienie jest równe i uzyskaj stosy obrazów o co najmniej 8 jednakowo odległych (250 nm) płaszczyznach. Następnie weź 3 sąsiadujące ze sobą reprezentatywne stosy obrazów z tego samego obszaru zainteresowania na wycinek.
      UWAGA: Głębokość może się różnić w zależności od warstwy, ale zawsze powinna wynosić około 2 - 5 μm od powierzchni warstwy.
   5. Powtórz akwizycję w co najmniej 3 plasterkach na warunek i od 6 do 8 zwierząt na grupę leczoną.

Tabela 1: Bufory używane do barwienia immunofluorescencyjnego.

Blocking/permeabilizing Buffer	Concentration	Notes
Serum osła	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH do 7,4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM	KH2PO4	18 mM		4% PFA/4% sacharozy		pH do 7,4
PBS	1x	Rozcieńczony od 10x
PFA	1.33 M
Sacharoza	117 mM

Results

Tabela 1: Bufory używane do barwienia immunofluorescencyjnego.

Blocking/permeabilizing Buffer

Materials