Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Streszczenie

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu oceny architektury synaptycznej poprzez ich kolokalizację.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etyki zwierząt.

1. Przygotowanie ostrego plastra hipokampa

Usuń mózg myszy tak szybko, jak to możliwe, używając szpatułki i ostrych nożyczek, aby przeciąć czaszkę, i umieść go w lodowatym, natlenionym (95% O₂, 5% CO₂), sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym o wysokiej zawartości sacharozy (ACSF, ~100 mL).

2. Umieść mózg myszy na szalce Petriego i usuń móżdżek oraz mały fragment kory czołowej za pomocą skalpela, zanim przejdziesz przez linię środkową mózgu.
3. Umieść dwie półkule po stronie, która właśnie została wycięta i przyklej każdą półkulę do sceny wibratomu.
4. Wytnij odcinki o grubości 200 - 300 μm całego obszaru zainteresowania. W przypadku hipokampa należy uzyskać około 3 - 4 plastry na półkulę.
5. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś plastry do komory zanurzonej w natlenionym (95%_O2, 5% CO₂) ACSF. Utrzymywać w temperaturze 34 °C przez 30 min.
   UWAGA: Na tym etapie plastry mogą być traktowane aktywnymi środkami farmakologicznymi, takimi jak rekombinowane białka Dickkopf-1 (Dkk1), dodając środki do komory plastrów.
6. Za pomocą pędzla wyjmij plastry z komory, umieść je na 24-dołkowej płytce i utrwal je przez 20 minut do 1 godziny w 4% paraformaldehydzie (PFA)/4% sacharozie w temperaturze pokojowej (RT).
   Uwaga: PFA jest toksyczny, należy nosić odpowiednią ochronę.
7. Umyj plastry trzy razy w 1X buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS, 10 min każdy).
   UWAGA: Protokół można tutaj wstrzymać na 1 - 2 dni, o ile plastry są przechowywane w temperaturze 4 °C w 1X PBS.

2. Immunofluorescencja markerów synaptycznych

UWAGA: Receptury wszystkich użytych buforów można znaleźć w Tabeli 1.

1. W dołkach kropelkowych zastąp PBS buforem blokującym/przepuszczalnym (Tabela 1) i inkubuj w temperaturze RT przez 4 - 6 godzin.
2. Rozcieńczyć poliklonalne przeciwciało świnki morskiej przeciwko pęcherzykowatemu transporterowi glutaminianu 1 (vGlut1) w rozcieńczeniu 1:2,000 w buforze blokującym/przepuszczalnym.
   UWAGA: vGlut1 jest markerem do wizualizacji presynaptycznego końca pobudzającego. Do identyfikacji postsynaptycznej synapsy pobudzającej należy użyć przeciwciała poliklonalnego przeciwko gęstości postsynaptycznej-95 (PSD-95) i rozcieńczyć 1:500 w tym samym roztworze. Użyć minimalnej objętości 300 μl w każdym dołku. Aby zidentyfikować anatomiczną lokalizację hipokampa, użyj przeciwciała, które może również zidentyfikować strukturę neuronalną, takiego jak białko związane z mikrotubulami 2 (MAP2) lub tubulina. Opracuj prawidłowe stężenia wszystkich pierwszorzędowych przeciwciał dla wybranych markerów synaptycznych (pre- i postsynaptycznych) i rozcieńcz w świeżym buforze blokującym/przepuszczalnym.
3. Inkubować plastry w roztworze przeciwciała przez noc (lub przez 1 - 2 dni) w temperaturze 4 °C. Energicznym ruchem należy używać platformy do wytrząsania.
4. Umyj plastry trzy razy w PBS (10 min każdy).
5. Rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:500 w buforze blokującym. Na przykład, używając przeciwciała świnki morskiej vGlut1, należy zastosować przeciwciało drugorzędowe, które rozpoznaje składnik świnki morskiej (np. anty-świnka morska osła) sprzężony ze specyficznym fluoroforem. W przypadku stosowania przeciwciała królika PSD-95 należy zastosować przeciwciało drugorzędowe, które rozpoznaje składnik królika (np. anty-królik osła) sprzężony z innym specyficznym fluoroforem.
6. Inkubuj plastry w tym roztworze przez 2 - 3 godziny w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że plastry są chronione przed światłem, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło.
7. Umyj plastry trzy razy w PBS (10 min każdy).
8. Ostrożnie usuń plastry z 24-dołkowej płytki za pomocą pędzla i ułóż je równomiernie na wstępnie oznaczonych szkiełkach. Dodaj kroplę podłoża montażowego na wierzch każdego plasterka, a następnie delikatnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu plastrów. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. Należy pamiętać, aby użyć wystarczającej ilości podłoża montażowego (300-400 μL), ponieważ niewystarczająca ilość może prowadzić do wysuszenia plastrów.
9. Pozostaw do wyschnięcia na minimum 1 - 2 dni w temperaturze RT i chroń slajdy przed światłem.
10. Przechowuj slajdy w temperaturze 4 °C przez krótki czas, ale w przypadku długoterminowego przechowywania, utrzymuj je w temperaturze -20 °C.

3. Konfokalne pozyskiwanie i analiza

1. obrazuObrazowanie za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.
   1. Zidentyfikuj obszar hipokampa, który ma być zobrazowany (np. rogówkę amonisową 1 i 3 (CA1, CA3) lub zakręt zębaty (DG)) za pomocą obiektywu 10x lub 20x.
   2. Zmień na 40-krotny lub 63-krotny cel zanurzenia w olejku, aby upewnić się, że anatomia plastra jest nienaruszona, identyfikując ciągłe neuryty i zorganizowaną strukturę. Użyj markera neuronalnego, takiego jak MAP2, jako odniesienia (Figura 1A).
   3. Następnie przełącz się na obiektyw z 60-krotnym zanurzeniem w oleju (apertura numeryczna [NA] = ~1,3 - 1,4) i dostosuj ustawienia dla każdego kanału, aby uzyskać optymalny sygnał i kontrast. Użyj opcji wysokiego/niskiego kontrastu, aby ustawić intensywność każdego lasera, aby uniknąć nasycenia jakichkolwiek pikseli.
      UWAGA: Te ustawienia będą zależeć od użytego mikroskopu, ale zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat ustawień mocy lasera. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli. Ustawienia powinny pozostać niezmienne w różnych warunkach tego samego eksperymentu. W razie potrzeby można zastosować dodatkowe powiększenie.
   4. Oceń głębokość, na której barwienie jest równe i uzyskaj stosy obrazów o co najmniej 8 jednakowo odległych (250 nm) płaszczyznach. Następnie weź 3 sąsiadujące ze sobą reprezentatywne stosy obrazów z tego samego obszaru zainteresowania na wycinek.
      UWAGA: Głębokość może się różnić w zależności od warstwy, ale zawsze powinna wynosić około 2 - 5 μm od powierzchni warstwy.
   5. Powtórz akwizycję w co najmniej 3 plasterkach na warunek i od 6 do 8 zwierząt na grupę leczoną.

Tabela 1: Bufory używane do barwienia immunofluorescencyjnego.

Blocking/permeabilizing Buffer	Concentration	Notes
Serum osła	10%
Triton-X	0.50%
PBS	1x
10x PBS		pH do 7,4
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM	KH2PO4	18 mM		4% PFA/4% sacharozy		pH do 7,4
PBS	1x	Rozcieńczony od 10x
PFA	1.33 M
Sacharoza	117 mM

Wyniki

Tabela 1: Bufory używane do barwienia immunofluorescencyjnego.

Blocking/permeabilizing Buffer

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Vibratome	Leica	VT1000S
Przeciwciało pierwotne	Millipore	AB5905	vGlut1 (1:2000)
Przeciwciało pierwotne	Thermo Scientific	MA1-046	PSD-95 (1:500)
Pierwotne przeciwciało	Synaptic Systems	131 004	vGAT (1:500)
Pierwotne przeciwciało	Systemy synaptyczne	147011	Gefiryna (1:500)
Pierwotna przeciwciało	Abcam	ab5392	MAP2 (1:10000)
Przeciwciało wtórne	Jackson Laboratories	706-545-148	Osioł Anty-Świnka Morska Alexa Fluor 488 (1:600)
Przeciwciało wtórne	Abcam	ab175470	Osioł Anty-Królik Alexa Fluor 568 (1:600)
Średni montaż	SouthernBiotech	00-4958-02	Fluoromount-G
Mikroskop konfokalny	Olympus	NA	Mikroskop konfokalny FV1000 wykorzystujący obiektyw olejowy o aperturze numerycznej 60x 1,35. W przypadku vGlut1 użyj lasera 488 o mocy procentowej 14%. Do PSD-95 użyj lasera 559 o mocy procentowej 20%.
Oprogramowanie analityczne	PerkinElmer	NA	Wielkość
Skalpel	Swann-Morton	203	No 11
Super Glue	Loctite	1446875
95% O2, 5% CO2	BOC	NA	Cylinder
24-dołkowa płyta	Corning	3524
Szkiełka szklane	Thermo	7107	08-1,0mm grubości
Petri Dish	Corning	430167
Myszy iDkk1	N/A	N/A	Myszy uzyskano przez skrzyżowanie transgenicznych myszy tetO Dkk1 z transgenicznymi myszami CaMKIIα rtTA2. Transgeniczne myszy TetO Dkk1 i CaMKIIα rtTA2 skrzyżowano w stanie heterozygotycznym. Obie linie myszy zostały wyhodowane na tle C57BL/6J. Jako grupę kontrolną wykorzystano pojedyncze rodzeństwo transgeniczne i z miotu WT.
Odczynniki do roztworów:
NaCl	Sigma	V800372
KCl	Sigma	P9333
Na2HPO4	Sigma	255793
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl2	Sigma 223506
MgCl2	Sigma	M9272
NaH2PO4	Sigma	71505
Kwas kynureninowy	Sigma	K3375
NaHCO3	Sigma	S5761
Kwas pirogronowy	Sigma	107360
EDTA	Sigma	E6758
D-Glucose	Sigma	G5767
Sacharoza	Sigma	S8501
Triton-X	Sigma	T8787
Serum dla osła	Millipore	S30-100ml
PFA	Sigma	P6148