Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Streszczenie

Źródło: Kennedy, L. H., et. al. Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy poklatkowe mitochondriów z czerwoną fluorescencją, a następnie obrazy stosu Z oligodendrocytów z zieloną fluorescencją.

Protokół

1. Przygotowanie plastrów organotypowych

UWAGA: W tym przepisie wykorzystuje się dwa młode myszy w 7-9 dniu po urodzeniu (p7-9), dając 24 organotypowe plastry podzielone na dwie sześciodołkowe szalki hodowlane. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnym kapturze, należy używać rękawiczek nitrylowych lub lateksowych. Należy stosować wyłącznie składniki przeznaczone do hodowli komórkowych.

1. Do przygotowania plastrów użyto butelek z autoklawem, narzędzi do rozwarstwiania (1 duże nożyczki, 1 małe nożyczki, 1 duża płaska szpatułka, 1 mała zaokrąglona i zaostrzona szpatułka oraz 1 kleszcze; szczegółowe informacje można znaleźć na liście materiałów), szklane pipety, końcówki do pipet i chusteczki higieniczne.
2. Ponieważ połowa szklanych pipet powinna być używana z dużym otworem, oderwij wąską końcówkę.
   1. Naciąć pisakiem diamentowym (jeśli jest dostępny) wokół pipety tuż poniżej punktu, w którym szklanka zaczyna się zwężać. Następnie umieść spiczasty koniec pipety w rękawicy nitrylowej lub podobnej. Ostrożnie odłamać końcówkę, zginając pipetę, jednocześnie dociskając ją do stołu warsztatowego.
   2. Następnie stępić złamany koniec, pocierając go o kawałek papieru ściernego lub lekko stopić na palniku Bunsena. Złamane pipety służą do przenoszenia pociętych plasterków mózgu, przy czym złamany koniec zamienia się w gumową bańkę, a duży otwarty koniec dotyka roztworu/plasterków.
      UWAGA: Nie robi się tego w sterylnym kapturze i można to zrobić kilka dni wcześniej.
3. Przygotuj potrawy kulturowe.
   UWAGA: Można to zrobić dzień przed krojeniem lub co najmniej 2 godziny przed krojeniem.
   1. Sterylizuj membrany z politetrafluoroetylenu (PTFE) ("konfetti"). Użyj dwóch sterylnych kleszczy, aby usunąć pojedyncze konfetti z otaczających niebieskich kawałków plastiku. Następnie sterylizuj, zanurzając dwukrotnie na szalce Petriego zawierającej 96% etanolu (EtOH). Następnie połóż konfetti płasko na sterylnej dużej szalce Petriego do wyschnięcia.
      UWAGA: Konfetti to hydrofilowe membrany PTFE podobne do membran we wkładkach hodowlanych. Użycie konfetti wspomaga obrazowanie na żywo, ponieważ pojedyncze plasterki można łatwo przenieść z wkładki do zestawu mikroskopowego poprzez podniesienie konfetti za pomocą kleszczyków (szczegóły patrz 4.8). Alternatywnie, plastry mózgu można hodować bez konfetti (w którym plastry przyczepiają się bezpośrednio do membrany wkładki hodowlanej). W takim przypadku wkładkę membrany należy przeciąć skalpelem, aby przenieść plasterek do kąpieli mikroskopowej.
   2. Dodaj 1 ml pożywki hodowlanej do każdej studzienki z sześciodołkowymi szalkami hodowlanymi.
   3. Umieść jedną wkładkę hodowlaną w każdym dołku za pomocą sterylnych kleszczy. Unikaj pęcherzyków powietrza między wkładką a pożywką hodowlaną.
      UWAGA: Aby zaoszczędzić pieniądze i środowisko, możliwe jest ponowne wykorzystanie wkładek kulturowych. Można to zrobić poprzez dokładne płukanie w wodzie destylowanej (dH₂O), a następnie inkubację w 70% EtOH przez minimum 24 godziny do ponownego użycia. Przygotowując się do nowej hodowli, wysusz inserty na płytce do hodowli komórkowej w świetle ultrafioletowym (UV) przez 15-30 minut.
   4. Umieść dwa (wysterylizowane i suche) konfetti na każdej z wkładek hodowlanych. Umieść konfetti w kierunku krawędzi wkładek, aby zminimalizować zachodzenie na siebie.
   5. Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO₂.
4. Zimne bąbelkowe podłoże preparacyjne z gazem dwutlenkowym (95% O₂/5%CO₂). Aby roztwór był sterylny, podłącz probówkę z butli z gazem do sterylnego filtra strzykawkowego (wielkość porów 0,22 μm).
   1. Podłącz drugi koniec filtra strzykawkowego do sterylnej rurki podłączonej do sterylnej szklanej pipety. Umieść szklaną pipetę w roztworze, przykryj ją parafilmem i włącz gaz. Utrzymuj podłoże preparacyjne na lodzie.
5. Przygotuj obszar rozwarstwiania/krojenia.
   UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby ta procedura była wykonywana w sterylnym kapturze. Jeśli nie jest to możliwe, wibratom można pozostawić na stole warsztatowym. W takim przypadku zaleca się stosowanie siatki na włosy i maski na twarz.
   1. Za pomocą jednoostrzowej żyletki wytnij prostokątny kawałek (około 2 cm x 0,5 cm) żelu agarozowego i przyklej go do stolika wibratomu tak, aby dłuższy bok był skierowany w stronę ostrza wibratomu.
   2. Oczyść wszystkie powierzchnie i części wibratomu 70% EtOH i przetrzyj autoklawowanymi chusteczkami do tkanek.
      UWAGA: Ważne jest, aby wszystkie kawałki, które będą miały kontakt z tkanką mózgową, były całkowicie suche, ponieważ EtOH może uszkodzić komórki.
   3. Przymocuj sterylną żyletkę do wibratomu i wykonaj test wibracji, aby sprawdzić, czy wibratom ma tę funkcję.
   4. Umieść w kapturze autoklawowane narzędzia do preparowania, autoklawowane chusteczki higieniczne, cztery małe szalki Petriego, skalpel o zaokrąglonych krawędziach, dwie szklane pipety z gumowymi gruszkami, dwie otwarte szklane pipety (patrz ppkt 1.1) i super klej (spryskany EtOH).
   5. Wlej bąbelkowaną pożywkę do rozwarstwiania do łodzi wibratomicznej i do czterech małych szalek Petriego.
      UWAGA: Ten krok powinien być wykonywany tylko bezpośrednio przed sekcją, ponieważ pożywka od tego momentu nie jest bąbelkowana ani trzymana na lodzie.
6. Analizuj i montuj mózgi.
   UWAGA: Aby uzyskać zdrowe plasterki, ten krok musi być wykonany szybko i precyzyjnie. Potrzebna jest pewna praktyka.
   1. Poddaj zwierzę eutanazji #1 poprzez zwichnięcie szyi lub zgodnie z lokalnymi wytycznymi, a następnie odetnij głowę dużymi nożycami.
   2. Za pomocą małych, ostrych nożyczek szybko usuń skórę, wykonując strzałkowe nacięcie od szyi do nosa i odciągnij je na bok, aby odsłonić czaszkę.
      1. Przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego, a następnie boczne nacięcia nad wewnętrzną częścią kości czołowych i szwem lamboidalnym (granica między mózgiem a móżdżkiem).
      2. Użyj kleszczy, aby zgiąć czaszkę z każdej strony. Nerwy czaszkowe są odcinane od mózgu poprzez włożenie zaokrąglonej, ostrej szpatułki pod brzuszną stronę mózgu i delikatne przesuwanie szpatułki na boki.
   3. Użyj żyletki z jednym ostrzem, aby wykonać koronalne cięcie rostralne do móżdżku.
      UWAGA: To cięcie określi kąt, pod jakim zostaną przycięte plasterki. Dlatego powinien być wykonany pod kątem prostym.
   4. Odwróć mózg z czaszki do małej szalki Petriego zawierającej podłoże do preparacji.
   5. Powtórz kroki 1.6.1. - 1.6.4. dla zwierzęcia #2 i umieść ten mózg na drugiej szalce Petriego.
      UWAGA: Zwierzęta nie są bezpłodne. Wykonaj sekcję po jednej stronie kaptura, a następnie przejdź na drugą, czystą stronę po usunięciu mózgu z czaszki.
   6. Zmień rękawiczki.
   7. Przymocuj mózg do sceny wibratomu: dodaj cienką warstwę super kleju do sceny tuż przed zamontowanym żelem agarozowym. Przytrzymaj mózg #1 dużą płaską szpatułką tak, aby świeżo ścięta (ogonowa) strona dotykała szpatułki, a strona brzuszna była skierowana (i była jak najbliżej) żelu agarozowego.
      1. Następnie delikatnie umieść mózg na kleju, spychając go ze szpatułki za pomocą zestawu kleszczy. Upewnij się, że zostawiłeś wystarczająco dużo miejsca na mózg #2.
         UWAGA: Ważne jest, aby mózgi były dobrze przymocowane do sceny, ale bez nadmiernego kleju, ponieważ może to utrudnić cięcie.
   8. Natychmiast po zamontowaniu mózgu #1 użyj dużej szpatułki, aby dodać kilka kropli pożywki preparacyjnej na wierzch mózgu. Dzięki temu mózg będzie wilgotny, utwardzi klej i zapobiegnie jego przywieraniu do boków mózgu.
   9. Powtórz kroki 1.6.7 i 1.6.8. dla mózgu #2.
   10. Przymocuj stolik do łodzi wibratomowej.
7. Wytnij plastry koronalne o grubości 230 μm o amplitudzie 1 - 1,5 mm, częstotliwości 85 Hz i prędkości 0,2 mm/s. Zbieraj plastry w przybliżeniu między 1,4 mm rostral a 2,1 mm ogonowo do Bregma.
   1. Zebrać plastry po pokrojeniu każdego plasterka za pomocą otwartych szklanych pipet (pkt. 1.1). Przenieść plastry na szalkę Petriego zawierającą podłoże do preparacji. Użyj zaokrąglonego skalpela, aby pokroić plastry na dwie części, dzieląc dwie półkule.
8. Gdy wszystkie plastry zostaną pokrojone, umieść je w naczyniach z kulturami.
   1. Wyjmij szalkę hodowlaną (pojedynczo) z inkubatora.
   2. Używając szklanych pipet z otwartym końcem, ostrożnie przenieś jeden plasterek do każdego z konfetti.
      UWAGA: Plastry powinny leżeć płasko na środku konfetti. Wymaga to pewnych umiejętności. Jeśli jednak niektóre plastry nie są idealne, lepiej je zostawić, niż tracić czas na próby ich przeniesienia, ponieważ ważne jest, aby jak najszybciej umieścić wszystkie plastry w inkubatorze.
   3. Użyj szklanej pipety (spiczasty koniec), aby delikatnie usunąć nadmiar podłoża bez dotykania plasterka.
      UWAGA: Plastry nie powinny być zanurzane w płynie podczas inkubacji. W związku z tym nadmiar pożywki należy zassać tak, aby plastry były wystawione na działanie powietrza (cienka warstwa pożywki nadal będzie pokrywać plastry). Plastry, które pozostaną zanurzone w płynie, będą zwykle niezdrowe lub umrą (4 i nasze obserwacje).
   4. Przenieś naczynie z powrotem do inkubatora, gdy wszystkie konfetti będą miały jeden plasterek.
   5. Powtórz kroki 1.7.8. - 1.8.4. Na danie #2.
9. Zmień pożywkę hodowlaną.
   UWAGA: Należy to zrobić dzień po pokrojeniu (dzień 1 in vitro, DIV1), a następnie co 2-3 dni.
   1. Podgrzej pożywkę w łaźni wodnej lub w inkubatorze.
   2. W sterylnym kapturze użyj odsysania próżniowego lub zwykłej pipety ze sterylną końcówką, aby zassać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki. Odbywa się to poprzez delikatne przechylenie naczynia (o około 30 stopni) i umieszczenie końcówki pipety na krawędzi wkładu hodowlanego.
   3. Usuń około 800 μl z każdej studzienki (pozostawiając tylko tyle podłoża, aby dno wkładki było pokryte podłożem). Następnie, za pomocą czystej pipety, dodaj 800 μl podgrzanego podłoża do każdego dołka. Następnie umieść szalki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.

2. Transdukcja wirusa

1. Kup lub stwórz wirusy związane z adenowirusami (AAV) z plazmidem będącym przedmiotem zainteresowania.
   UWAGA: Ten protokół opisuje użycie serotypu AAV 2/8 (AAV 2/8) przenoszącego mitochondrialny celowany dsred lub GFP jako gen reporterowy pod kontrolą transkrypcyjną promotora podstawowego białka mieliny12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred lub AAV2/8 MBP_mito_GFP) do wizualizacji mitochondriów oligodendrocytów. AAV 2/8 przenoszący GFP lub tdtomato jako gen reporterowy sterowany przez ogólny promotor CAG (AAV 2/8 CAG_GFP lub AAV 2/8 CAG_tdtomato) służy do wizualizacji cytoplazmy oligodendrocytów. Tak więc połączenie MBP_mito_dsred AAV2/8 z AAV 2/8 CAG_GFP daje czerwone mitochondria i zieloną cytoplazmę w oligodendrocytach, podczas gdy połączenie MBP_mito_GFP AAV2/8 i AAV 2/8 CAG_tdtomato daje zielone mitochondria i czerwoną cytoplazmę. Konstrukty te zostały opisane bardziej szczegółowo w innym miejscu13.
2. W 7 dniu in vitro (DIV7) dochodzi do transdukcji oligodendrocytów z AAV.
   UWAGA: Przestrzegaj przepisów bezpieczeństwa podczas pracy z AAV. Upewnij się, że masz odpowiednie szkolenie i wymagane jest zatwierdzenie poziomu bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie poniższe punkty należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przy użyciu rękawic i fartucha laboratoryjnego. Tutaj opisano zastosowanie AAV do obszaru kory mózgowej plastrów, ponieważ jest to obszar, który wykazuje najlepszą regenerację.
   1. Rozcieńczyć AAV w podgrzanej (37 °C) pożywce hodowlanej. Zaleca się rozcieńczenia około 2 × 10⁹ kopii genomu/ml (GC/ml), aby uzyskać rzadką transdukcję oligodendrocytów, która umożliwia obrazowanie pojedynczych komórek w wycinku. Należy jednak przeprowadzić pilotaż z zastosowaniem różnych mian, aby zapewnić gęstość transdukowanych oligodendrocytów, która jest odpowiednia dla konkretnych eksperymentów. Jeśli używane są dwa różne AAV, należy je wymieszać w tym samym roztworze i jednocześnie dodać do plasterka.
   2. Dodaj około 1,3 μl rozcieńczonego AAV do każdego plasterka. Upewnij się, że zewnętrzna strona końcówki pipety jest sucha. Odpipetować 1,3 μl rozcieńczonego AAV i trzymać pipetę nad korą mózgową tak blisko, jak to możliwe, nie dotykając plasterka końcówką pipety (w odległości około 1 mm).
   3. Następnie powoli wypchnij roztwór z pipety. Gdy roztwór dotknie plasterka, przesuń końcówkę pipety po korze mózgowej, aby rozprowadzić roztwór na całym obszarze kory.
      UWAGA: Ta procedura powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć trzymania plastrów poza kapturem dłużej niż to konieczne. Zrób to na jednym talerzu na raz i włóż pierwsze naczynie z powrotem do inkubatora przed rozpoczęciem na talerzu #2. Uzyskanie zadowalającej dystrybucji AAV bez uszkadzania tkanki wymaga pewnej praktyki i pewnej ręki.
3. Jeśli w laboratorium komórkowym dostępny jest pionowy mikroskop fluorescencyjny, ekspresję białka można sprawdzić w czasie hodowli, umieszczając naczynie pod mikroskopem.
   UWAGA: Naczynie nie powinno być trzymane poza inkubatorem dłużej niż 2 - 5 minut.

3. Obrazowanie poklatkowe

UWAGA: Obrazowanie można przeprowadzić, gdy poziomy ekspresji markerów fluorescencyjnych są wystarczające, a plastry wyglądają zdrowo (zwykle DIV11-14).

1. Upewnij się, że mikroskop, perfuzja i ogrzewanie są prawidłowo ustawione, tak aby bąbelkowy roztwór obrazowania był podgrzewany i mógł wchodzić i wychodzić z kąpieli.
   UWAGA: Istnieją różne rozwiązania dla komór kąpielowych. Prosta wersja jest przedstawiona tutaj.
   1. Wykonaj wchodzenie i wyloty wanny za pomocą tępych igieł strzykawek (wygiętych pod kątem ~45°), które są przymocowane do boków wanny za pomocą kleju blu-tack/fun.
   2. Upewnij się, że rurka przechodzi z butelki z roztworem do obrazowania z pęcherzykami powietrza przez pompę perystaltyczną, przez rurkę grzewczą jednostki grzewczej, a następnie do igły strzykawki wlotowej w kąpieli.
   3. Podłączyć kolejną rurkę do wylotu igły strzykawki. Rurka ta przechodzi następnie przez pompę perystaltyczną i wraca do butelki z roztworem do obrazowania (lub do butelki na odpady).
2. Roztwór do obrazowania pęcherzykowego z gazowym wodorotlenkiem.
   UWAGA: To powinno być rozpoczęte co najmniej 15 minut przed obrazowaniem i kontynuowane przez cały eksperyment.
3. Włączyć pompę perystaltyczną i grzałkę, a następnie przepuścić roztwór przez kąpiel, aby uzyskać optymalną temperaturę kąpieli (37 ± 0,5 °C). Upewnij się, że czujnik termometru podłączony do jednostki temperatury jest zanurzony w roztworze kąpieli.
4. Włącz mikroskop, lampę fluorescencyjną i odpowiednie lasery.
5. Ustaw odpowiednią ścieżkę światła dla próbki.
   UWAGA: To będzie się różnić w zależności od konfiguracji mikroskopu i sondy. Ogólna wiedza na temat korzystania z mikroskopu konfokalnego jest wymagana i nie będzie tutaj omawiana.
6. Użyj obiektywu do zanurzenia w wodzie o odpowiednim powiększeniu i aperturze numerycznej (nie dotyczy). Używamy obiektywu planapochromatycznego z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie (n.d. 1.0).
7. Otwórz otwór, aby uzyskać przekrój optyczny około 2 - 2,5 μm dla filmu poklatkowego. Zmniejsza to występowanie mitochondriów przesuwających się poza ostrość podczas filmu poklatkowego.
8. Przenieś plasterek organotypowy do kąpieli:
   1. Dodaj kroplę roztworu do obrazowania lub pożywki hodowlanej na małą plastikową szalkę Petriego.
   2. W sterylnym kapturze użyj sterylnych kleszczyków, aby przenieść jeden plasterek organotypowy z wkładki membranowej do kropli. Kleszcze powinny dotykać tylko konfetti, a nie plasterka.
   3. Przykryj szalkę Petriego pokrywką.
   4. Natychmiast umieść naczynie hodowlane zawierające resztę plastrów z powrotem w inkubatorze.
   5. Przynieś szalkę Petriego zawierającą plasterek do mikroskopu.
   6. Wyłączyć pompę perystaltyczną podczas przenoszenia plastra do kąpieli mikroskopowej. Najpierw użyj kleszczy, aby podnieść konfetti z plasterkiem z szalki Petriego na wierzch wanny (konfetti będzie się unosić). Następnie umieść dwie końcówki kleszczy po obu stronach konfetti tak, aby dotykały konfetti bez dotykania plasterka, i przepchnij konfetti przez roztwór na dno wanny. Wyśrodkuj konfetti na środku wanny.
   7. Użyj kleszczy, aby umieścić kotwicę dociskową (harfę) na wierzchu konfetti bez dotykania plasterka.
      UWAGA: Harfa to platynowa kotwica w kształcie podkowy, która służy do zapobiegania unoszeniu się lub dryfowaniu plastra w wannie. W przypadku ostrych plastrów cienkie struny biegną z jednej strony harfy na drugą (przypominając harfę muzyczną). W przypadku plastrów organotypowych harfa powinna być bezsznurkowa i dopasowana do rozmiaru konfetti w taki sposób, aby mogła leżeć na wierzchu konfetti bez dotykania plasterka.
   8. Ponownie włącz pompę perystaltyczną.
9. Opuścić obiektyw w dół do próbki.
10. Wybierz komórkę i region do obrazu.
    UWAGA: Unikaj nadmiernej ekspozycji komórek na światło lasera, ponieważ może to spowodować toksyczność komórek (patrz wskazówki w punktach poniżej).
    1. Użyj okularów i świetlówki, aby znaleźć zdrowo wyglądający oligodendrocyt o prawidłowym wyrazie. Zazwyczaj oligodendrocyty, które mają silną nadekspresję białka fluorescencyjnego, wydają się niezdrowe. Niezdrowe oligodendrocyty będą miały procesy o wyglądzie blobby, a mitochondria będą wyglądały na pofragmentowane. W zdrowych oligodendrocytach soma i procesy wydają się gładkie, a mitochondria mają różną długość (chociaż zwykle są znacznie krótsze niż w neuronach i astrocytach).
    2. Umieść interesującą Cię komórkę na środku pola widzenia.
    3. Użyj funkcji "na żywo" w oprogramowaniu (dla mikroskopów Leica i Zeiss), aby zidentyfikować komórkę na ekranie i wybrać obszar zainteresowania, np. część komórki, która zawiera kilka procesów pierwotnych lub osłonek mielinowych lub pojedynczy proces lub osłonkę mielinową.
       UWAGA: Aby móc zobrazować jak najwięcej procesów/osłon, wybierz obszary zawierające procesy, które leżą względnie płasko w kierunku x-y.
    4. Powiększ pole zainteresowania (zwykle tworząc obraz o rozmiarze piksela 0,14 - 0,30 μm).
    5. Za pomocą narzędzia "regiony" narysuj prostokąt wokół obszaru i wybierz opcję skanowania tylko wybranego regionu. Czas skanowania, a co za tym idzie ekspozycja lasera, jest skracany przez skanowanie tylko wybranego obszaru.
       UWAGA: Prostokątne regiony poziome będą skanowane szybciej niż regiony pionowe ze względu na mniejszą liczbę potrzebnych linii skanowania. Jeśli skanowany jest pionowy obszar prostokątny, czas skanowania można skrócić, obracając pole skanowania o 90 stopni (za pomocą narzędzia do obracania).
11. Dostosuj moc i wzmocnienie lasera, aby uzyskać dobry widok mitochondriów.
    UWAGA: Użyj minimalnej wymaganej mocy lasera. Jeśli to możliwe, zwiększaj wzmocnienie, a nie zwiększaj moc lasera. Oprócz powodowania toksyczności komórek, zbyt wysoka moc lasera z czasem wybiela obrazowane obiekty, co wymaga dalszego zwiększenia mocy lasera lub wzmocnienia podczas skanowania. Wymagana moc i wzmocnienie lasera będą zależeć od poziomu ekspresji i mikroskopu. W mikroskopie konfokalnym LSM700 do obrazowania DSRED lub tdtomato używamy lasera o długości fali 555 nm i mocy 20-40 μW, a do obrazowania GFP (moc lasera mierzona na tylnej aperturze obiektywu) wykorzystuje się laser o długości fali 488 nm o mocy 20 - 30 μW. Wzmocnienie jest ustawione na wysokim poziomie dla obrazowania na żywo, zwykle w zakresie 700 - 800 dla GFP i 850-980 dla dsred i tdtomato. Wysokie wzmocnienie może powodować więcej szumów tła, które są usuwane przez zwiększenie przesunięcia cyfrowego (wartości przesunięcia zwykle mieszczą się w zakresie od 0 do 15). Z naszego doświadczenia wynika, że użycie MBP_mito_GFP daje lepszy stosunek sygnału do szumu niż MBP_mito_dsred.
12. Wybierz szybkość skanowania.
    UWAGA: Zminimalizuj czas skanowania, używając dużej prędkości skanowania i rysując mały obszar skanowania (patrz punkt 4.10.5 poniżej). Możliwe jest również zaoszczędzenie czasu skanowania poprzez wykonanie skanowania dwukierunkowego. Nie jest to jednak zalecane ze względu na gorszą jakość obrazu.
13. Ustaw częstotliwość i czas trwania nagrywania poklatkowego, np. Rób obrazy co 2 sekundy przez łącznie 20 minut w celu obrazowania mitochondriów w oligodendrocytach.
    UWAGA: Częstotliwość i czas trwania powinny być ustawione zgodnie z ruchliwością obiektów zainteresowania. Wyższa częstotliwość wystawi próbkę na działanie większej ilości światła laserowego, ale szybciej poruszające się obiekty wymagają również krótszego całkowitego czasu trwania filmów poklatkowych (np. mitochondria w neuronach, które poruszają się częściej i ze znacznie większą prędkością niż mitochondria w oligodendrocytach, są zwykle obrazowane co sekundę przez łącznie 2 minuty).
14. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe.
    UWAGA: Mitochondria mogą przesunąć się z ostrości i/lub wysunąć się z obrazowanego obszaru podczas nagrywania. Aby zminimalizować wibracje i ruch, wyreguluj wloty i wyloty wanny i w razie potrzeby zmniejsz prędkość pompy. Zwykle nadal występują niewielkie zmiany ostrości. W związku z tym wymagane jest ciągłe monitorowanie ekranu podczas obrazowania, z niewielkimi korektami ostrości podczas nagrywania.

Przechwyć stos z całej komórki, aby w przyszłości zidentyfikować komórkę i zobrazowany proces.
UWAGA: Dla lepszej rozdzielczości, otwór powinien zostać zresetowany do 1 jednostki przewiewnej dla stosu z.

Materiały