Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy poklatkowe mitochondriów z czerwoną fluorescencją, a następnie obrazy stosu Z oligodendrocytów z zieloną fluorescencją.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu
984 wyświetleń
⸱
28 kwietnia 2025
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
1. Przygotowanie plastrów organotypowych
UWAGA: W tym przepisie wykorzystuje się dwa młode myszy w 7-9 dniu po urodzeniu (p7-9), dając 24 organotypowe plastry podzielone na dwie sześciodołkowe szalki hodowlane. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnym kapturze, należy używać rękawiczek nitrylowych lub lateksowych. Należy stosować wyłącznie składniki przeznaczone do hodowli komórkowych.
- Do przygotowania plastrów ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma | A9539 | |||||
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Igły używane do wchodzenia i wylotu wanny | ||||
| gaz dwutlenkowy | AGA | 105701 | |||||
| Żarówki do pipet marki | Sigma-Aldrich | Z615927 | Żarówki do pipet | ||||
| Palnik Bunsena (palnik na płynny propan) | VWR | 89038-530 | |||||
| Zestaw kabli do sterowników grzałki | Warner Instruments | 64-0106 | Regulator temperatury - część termometru | ||||
| Chlorek wapnia | Fluka | 21100 | |||||
| Dwutlenek węgla | AGA | 100309 | CO2 dla inkubatora | ||||
| Szkło nakrywkowe, kwadratowe Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | Do przymocowania pod wanną do obrazowania na żywo. Uszczelnij klejem lub wazeliną. | ||||
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |||||
| Delikatne kleszcze | Finescience | 11063-07 | Do sekcji | ||||
| Diamentowy pisak | Ted Pella Inc. | 54463 | |||||
| Jednorazowe szklane pipety Pasteura 230 mm | VWR | 612-1702 | Pipety szklane | ||||
| Żyletka z podwójną krawędzią ze stali nierdzewnej | Mikroskopia elektronowa Sciences | #7200 | Żyletka do wibratomu | ||||
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |||||
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 3,00,220 | Bibuła filtracyjna używana do filtracji PFA | ||||
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Służy do podłączania/regulacji położenia wlotów i odpływów w wannie | ||||
| Ręcznik do rąk C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |||||
| Harfa, płaska do komory RC-41, | Warner Instruments | 64-1418 | Harfa do przytrzymywania konfetti w wannie. Przed użyciem odetnij sznurki z plastrami organotypowymi. 1,5 mm, 13mm, SHD-41/15 | ||||
| HEPES, FW: 260,3 | Sigma | H-7006 | |||||
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Okap | ||||
| Serum dla konia, inaktywowane termicznie | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |||||
| KCl | Sigma | P9541 | |||||
| Membrana LCR, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti | ||||
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome | ||||
| MEM-Glutamax z HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |||||
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |||||
| Micro Spoon Heyman Type B | Nauki o mikroskopii elektronowej | 62411-B | Mała, zaokrąglona szpatułka z zaostrzona końcówka do sekcji | ||||
| Jednostka filtrująca Millex-GP | Millipore | SLGPM33RA | Jednostka | ||||
| Wkładka do hodowli komórkowych Millicell, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Wkładki | ||||
| Moduł sterowania prędkością Minipuls 3 | GILSON | F155001 | Pompa perystaltyczna do obrazowania na żywo - Część modułu sterującego (podłączyć do głowicy dwukanałowej) | ||||
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |||||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |||||
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |||||
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |||||
| Powierzchnia Nunclon Delta | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Płyta | ||||
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |||||
| Obiektyw W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Cel zanurzenia w wodzie używany do obrazowania na żywo. (WD=2.5mm), VIS-IR | ||||
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |||||
| Paraformaldehyde, granularny | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |||||
| Komora perfuzyjna PC-R | SiSkiYou | 15280000E | Wanna do obrazowania | ||||
| Penicylina-Streptomycyna, płyn | Invitrogen | 15070-063 | |||||
| szalka Petriego 140 mm | Heger | 1075 | Duża szalka | ||||
| szalka Petriego 92x16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Średnia szalka | ||||
| Petridish 55x14,2 mm | VWR | 391-0868 | Mały szalka Petriego | ||||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma | P4417 | tabletki PBS | R2 Dwukanałowa głowica | GILSON | F117800 | Pompa perystaltyczna do obrazowania na żywo - Dwukanałowa część głowicy (wymaga modułu sterującego) |
| Okrągłe/Płaskie szpatułki, Stal nierdzewna | VWR | 82027-528 | Duża szpatułka do sekcji | ||||
| Papier ścierny | VWR | MMMA63119 | Opcjonalnie, do wygładzania pipet | ||||
| Nożyczki, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Duże nożyczki do preparacji | ||||
| Nożyczki, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Małe, ostre nożyczki do preparacji | ||||
| Pojedyncza krawędź, ostrze klejnotu | Mikroskopia elektronowa Sciences | #71972 | Żyletka | ||||
| Grzałka liniowa SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Regulator temperatury - część | ||||
| Filtr Steritop-GP, 500 ml, 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filtr do sterylizacji roztworów | ||||
| Super precyzja kleju | Loctite | 1577386 | |||||
| Chirurgiczny ostrze skalpela nr 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Zaokrąglone ostrze | ||||
| Regulator temperatury TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Regulator temperatury do obrazowania na żywo (wymaga grzałki roztworu i zestawu kabli) | ||||
| Trizma base | Sigma | T1503 | |||||
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |||||
| inkubator z płaszczem wodnym seria II | Forma Scientific | 78653-2882 | Inkubator |
