Mikroskopia dwufotonowa do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związku w wycinku mózgu myszy

Abstract

Źródło: Etienne, F. i wsp. Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do badania przyciągania procesów mikroglejowych w kierunku wstrzykniętego związku w wycinkach mózgu. Zawiera przegląd przygotowywania wycinków mózgu myszy, wstrzykiwania związku testowego chemoatraktantu i obrazowania znakowanego fluorescencyjnie mikrogleju w celu wizualizacji ich reakcji.

Protocol

1. Mikroskopia dwufotonowa

1. Parameters setting
   1. Włącz system wielofotonowy (detektory hybrydowe, laser, skaner, modulator elektrooptyczny, mikroskop).
   2. UWAGA:UWAGA:i.e., nie najgłębsze z-slices, gdzie fluorescencja jest słaba]), lub zmniejszyć prędkość skanera. Rozdzielczość osiową można również zmniejszyć, zwiększając krok z do 3 μm, ale ponieważ może to mieć wpływ na kwantyfikację, wszystkie eksperymenty, które mają być porównane, powinny być wykonywane z tym samym krokiem z.
      UWAGA: ^GFP/+Umiejscowienie plastra i szklanej mikropipety oraz miejscowe zastosowanie związku
      1. Podłączyć pompę perystaltyczną do komory nagrywania, 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania. Po oczyszczeniu całego układu perfuzyjnego 50 ml ultraczystej wody, należy rozpocząć perfuzję komory rejestracyjnej za pomocą CSF (50 ml) zawartego w szklanej zlewce pod stałą karbonizacją. Przez cały czas trwania eksperymentu utrzymuj krążący aCSF na poziomie 32 °C za pomocą wbudowanego mikrogrzejnika lub grzałki Peltiera.
         UWAGA:Figure 1A,BUWAGA:UWAGA: UWAGA: ^-1Figure 2B).
      2. UWAGA: ., bardziej widoczne w ostatnim niż w pierwszym wycinku mózgu, który ma być zobrazowany). W związku z tym płaszczyzny z w pierwszych ~30 μm nie powinny być używane do analizy, a nawet można je pominąć do akwizycji.
      3. UWAGA:2. Analiza przyciągania procesów mikrogleju
         1. Projekcja 2D i korekta dryfu<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
         2. Otwórz plik (. LIF) z Fidżi.
         3. Image/Stacks/Tools/Make SubstackZ project function (Image/Stacks/Z project") i wybierz Maksymalna intensywność typ projekcji, aby uzyskać rzuty stosu z za każdym razem punkt.
         4. MultiStackReg plugin (Plugin/Registration/MultiStackReg), wybierając Działanie 1: Align oraz Transformacja: Rigid BodyPrzetwarzanie danych
            1. Otwórz ten nowy plik za pomocą Icy.
            2. R1ROI intensity evolution i zmierz średnią intensywność ponad czas w R1.
            3. Kwantyfikacja i przedstawienie wyników
               1. Aby określić ilościowo reakcję mikrogleju w czasie, określ w każdym punkcie czasowym.
                  Następnie wyniki można przedstawić jako kinetykę odpowiedzi mikrogleju lub w określonym punkcie czasowym (patrz Rysunek 3).

Results

Rysunek 1: Szczegóły komory interfejsu. (A) Zarys druku 3D uchwytu na plasterki. Średnica zewnętrzna uchwytu wynosi 7 cm. (B) Uchwyt na plasterki interfejsu z nylonową siatką (strzałka), która pozwala naukowcom utrzymać plastry na granicy faz ciecz-powietrze. (C) Urządzenie z komorą interfejsu, ...

Materials