Mikroskopia dwufotonowa do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związku w wycinku mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Etienne, F. i wsp. Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do badania przyciągania procesów mikroglejowych w kierunku wstrzykniętego związku w wycinkach mózgu. Zawiera przegląd przygotowywania wycinków mózgu myszy, wstrzykiwania związku testowego chemoatraktantu i obrazowania znakowanego fluorescencyjnie mikrogleju w celu wizualizacji ich reakcji.

Protokół

1. Mikroskopia dwufotonowa

1. Parameters setting
   1. Włącz system wielofotonowy (detektory hybrydowe, laser, skaner, modulator elektrooptyczny, mikroskop).
   2. UWAGA:UWAGA:i.e., nie najgłębsze z-slices, gdzie fluorescencja jest słaba]), lub zmniejszyć prędkość skanera. Rozdzielczość osiową można również zmniejszyć, zwiększając krok z do 3 μm, ale ponieważ może to mieć wpływ na kwantyfikację, wszystkie eksperymenty, które mają być porównane, powinny być wykonywane z tym samym krokiem z.
      UWAGA: ^GFP/+Umiejscowienie plastra i szklanej mikropipety oraz miejscowe zastosowanie związku
      1. Podłączyć pompę perystaltyczną do komory nagrywania, 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania. Po oczyszczeniu całego układu perfuzyjnego 50 ml ultraczystej wody, należy rozpocząć perfuzję komory rejestracyjnej za pomocą CSF (50 ml) zawartego w szklanej zlewce pod stałą karbonizacją. Przez cały czas trwania eksperymentu utrzymuj krążący aCSF na poziomie 32 °C za pomocą wbudowanego mikrogrzejnika lub grzałki Peltiera.
         UWAGA:Figure 1A,BUWAGA:UWAGA: UWAGA: ^-1Figure 2B).
      2. UWAGA: ., bardziej widoczne w ostatnim niż w pierwszym wycinku mózgu, który ma być zobrazowany). W związku z tym płaszczyzny z w pierwszych ~30 μm nie powinny być używane do analizy, a nawet można je pominąć do akwizycji.
      3. UWAGA:2. Analiza przyciągania procesów mikrogleju
         1. Projekcja 2D i korekta dryfu<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
         2. Otwórz plik (. LIF) z Fidżi.
         3. Image/Stacks/Tools/Make SubstackZ project function (Image/Stacks/Z project") i wybierz Maksymalna intensywność typ projekcji, aby uzyskać rzuty stosu z za każdym razem punkt.
         4. MultiStackReg plugin (Plugin/Registration/MultiStackReg), wybierając Działanie 1: Align oraz Transformacja: Rigid BodyPrzetwarzanie danych
            1. Otwórz ten nowy plik za pomocą Icy.
            2. R1ROI intensity evolution i zmierz średnią intensywność ponad czas w R1.
            3. Kwantyfikacja i przedstawienie wyników
               1. Aby określić ilościowo reakcję mikrogleju w czasie, określ w każdym punkcie czasowym.
                  Następnie wyniki można przedstawić jako kinetykę odpowiedzi mikrogleju lub w określonym punkcie czasowym (patrz Rysunek 3).

Wyniki

Rysunek 1: Szczegóły komory interfejsu. (A) Zarys druku 3D uchwytu na plasterki. Średnica zewnętrzna uchwytu wynosi 7 cm. (B) Uchwyt na plasterki interfejsu z nylonową siatką (strzałka), która pozwala naukowcom utrzymać plastry na granicy faz ciecz-powietrze. (C) Urządzenie z komorą interfejsu, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
for slice imaging<
× 25 0.95 NA zanurzenie w wodzie obiektyw	Leica Microsystems (Niemcy)	HCX Irapo
2-fotonowy mikroskop pionowy MP5 ze skanerami rezonansowymi (8 kHz) i dwoma detektorami HyD Hybrid	Leica Microsystems (Niemcy)
Antlia-3C Digital Peristaltic pump	DD Biolab	178961	Dla perfuzji w komorze 2-fotonowej za pomocą aCSF
Carbogen 5% dwutlenku węgla/95% tlenu	Air Liquide France Industrie
Chameleon Ultra2 Ti:laser szafirowy	Coherent (Niemcy)
Jednorazowe pipety transferowe, szerokie usta	ThermoFischer scientific	5.8ml z końcówką płetwy, ale przycięliśmy to (ok. 7cm), aby mieć usta o średnicy 4 mm
Filtr emisji SP680	Leica Microsystems (Niemcy)
Kostka fluorescencyjna zawierająca filtr emisyjny 525/50 i filtr dichroiczny 560 (do zbierania fluorescencji)	Leica Microsystems (Niemcy)
Szklana zlewka z 50 ml ACSF, aby utrzymać stałą perfuzję plasterka
Heating system	Warner Instrument Corporation	Automatic Heater Controller TC-324B	aby utrzymać roztwór perfuzyjny w temperaturze 32°C
Perfusion chamber			domowej roboty, plik do druku 3D znajduje się w Materiałach uzupełniających
Uchwyt na plasterki ("harfa")			home made: spinka do włosów wykonana z platyny z dwoma gałęziami połączonymi równoległymi nylonowymi nitkami
For
Hydrat soli disodowej adenozyno-5′-trifosforanu (ATP)	Sigma	A-26209	do przygotowania w późniejszym czasie: 1mg/ml (3mM) roztwór podstawowy przygotowany w dniu eksperymentu, przechowywany w temperaturze 4°C (kilka godzin) i rozcieńczony tuż przed użyciem
Fluoresceina (opcjonalnie)	Sigma	F-6377	użyj w 1 μM final
Micromanipulator	Luigs and Neumann	SM7	connected to micropipette holde
Uchwyt na mikropipety			tak samo jak dla eletrofizjologii
Chlorowodorek serotoniny	Sigma	H-9523	podwielokrotności 50 mM roztworu podstawowego w H20 utrzymywanego w temperaturze -20°C. Roztwór 500 μM przygotowany w dniu eksperymentu.
Strzykawka 5mL (bez igły)	Terumo medical products
Transparent tubing	11750105	Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing
For image analysis
Fiji		https://fiji.sc
Icy	Institut Pasteur	http://icy.bioimageanalysis.org
Mice
CX3CR1-GFP myszy	Jung et al, 2000		samiec lub samica, P3 do 2 miesięcy; Skrzyżowaliśmy wstecznie te myszy na tle 129SV.
CX3CR1creER-YFP mice	Parkhurst et al 2013		mężczyzna lub kobieta, P3 do 2 miesięcy; Skrzyżowaliśmy wstecznie te myszy na tle 129sv.

td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'> slice stimulation