Mikroskopia dwufotonowa do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związku w wycinku mózgu myszy

1. Mikroskopia dwufotonowa

1. Parameters setting
   1. Włącz system wielofotonowy (detektory hybrydowe, laser, skaner, modulator elektrooptyczny, mikroskop).
   2. UWAGA:UWAGA:i.e., nie najgłębsze z-slices, gdzie fluorescencja jest słaba]), lub zmniejszyć prędkość skanera. Rozdzielczość osiową można również zmniejszyć, zwiększając krok z do 3 μm, ale ponieważ może to mieć wpływ na kwantyfikację, wszystkie eksperymenty, które mają być porównane, powinny być wykonywane z tym samym krokiem z.
      UWAGA: ^GFP/+Umiejscowienie plastra i szklanej mikropipety oraz miejscowe zastosowanie związku
      1. Podłączyć pompę perystaltyczną do komory nagrywania, 30 minut przed rozpoczęciem nagrywania. Po oczyszczeniu całego układu perfuzyjnego 50 ml ultraczystej wody, należy rozpocząć perfuzję komory rejestracyjnej za pomocą CSF (50 ml) zawartego w szklanej zlewce pod stałą karbonizacją. Przez cały czas trwania eksperymentu utrzymuj krążący aCSF na poziomie 32 °C za pomocą wbudowanego mikrogrzejnika lub grzałki Peltiera.
         UWAGA:Figure 1A,BUWAGA:UWAGA: UWAGA: ^-1Figure 2B).
      2. UWAGA: ., bardziej widoczne w ostatnim niż w pierwszym wycinku mózgu, który ma być zobrazowany). W związku z tym płaszczyzny z w pierwszych ~30 μm nie powinny być używane do analizy, a nawet można je pominąć do akwizycji.
      3. UWAGA:2. Analiza przyciągania procesów mikrogleju
         1. Projekcja 2D i korekta dryfu<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
         2. Otwórz plik (. LIF) z Fidżi.
         3. Image/Stacks/Tools/Make SubstackZ project function (Image/Stacks/Z project") i wybierz Maksymalna intensywność typ projekcji, aby uzyskać rzuty stosu z za każdym razem punkt.
         4. MultiStackReg plugin (Plugin/Registration/MultiStackReg), wybierając Działanie 1: Align oraz Transformacja: Rigid BodyPrzetwarzanie danych
            1. Otwórz ten nowy plik za pomocą Icy.
            2. R1ROI intensity evolution i zmierz średnią intensywność ponad czas w R1.
            3. Kwantyfikacja i przedstawienie wyników
               1. Aby określić ilościowo reakcję mikrogleju w czasie, określ w każdym punkcie czasowym.
                  Następnie wyniki można przedstawić jako kinetykę odpowiedzi mikrogleju lub w określonym punkcie czasowym (patrz Rysunek 3).

Rysunek 1: Szczegóły komory interfejsu. (A) Zarys druku 3D uchwytu na plasterki. Średnica zewnętrzna uchwytu wynosi 7 cm. (B) Uchwyt na plasterki interfejsu z nylonową siatką (strzałka), która pozwala naukowcom utrzymać plastry na granicy faz ciecz-powietrze. (C) Urządzenie z komorą interfejsu, które umożliwia utrzymanie plastrów w karbonicznym (strzałka wskazuje rurkę do bulgotania) i wilgotnym środowisku przed ich obrazowaniem.

Rysunek 2: Szczegóły komory perfuzyjnej. (A) Zarys druku 3D. Średnica zewnętrzna komory perfuzyjnej wynosi 5,9 cm. (B) Komora perfuzyjna z nylonową siatką (strzałką), która podtrzymuje plasterek, zapobiega jego dotykaniu szkiełka poniżej i umożliwia przepływ aCSF nad i pod nim. (C) Zdjęcie zespołu przy mikroskopie dwufotonowym. Mikropipeta, która dostarczy związek lokalnie, jest widoczna po prawej stronie (gwiazdka). (D) Pipeta sfotografowana w jasnym polu. Podziałka = 60 μm.

Rysunek 3: Pozycja mikropipety w wycinku. Przykład akwizycji stosu obrazów (w hipokampie 30-dniowego zwierzęcia) za pomocą mikropipety wypełnionej fluoresceiną (1 μM). Fluoresceina umożliwia zlokalizowanie pipety (gwiazdki) w maksymalnych rzutach wzdłuż (A) osi z lub (B) osi y. Zauważ w panelu B, że chociaż fluorescencja jest słabsza, to pod końcówką pipety znajduje się również mikroglej. W tym ilustrowanym przykładzie do projekcji użyto całego stosu, w tym obrazów zrobionych w najbardziej powierzchownej części wycinka. Podziałka = 30 μm w panelu A i jak wskazano (każda podziałka = 50 μm) w panelu B. Grubość stosu z = 220 μm.

Rysunek 4: Przykłady nieoptymalnych eksperymentów. Te wycinki czekały ponad 6 godzin przed obrazowaniem i były obrazowane od ich górnej powierzchni. (A) Przykład stosu z dużą ilością zanieczyszczeń (z grubsza okrągłe, fluorescencyjne cząstki, ale z nieregularnymi obwódkami; gwiazdki) i "krzaczastym" mikroglejem (strzałki), czyli z licznymi, ale krótkimi wyrostkami. Zwróć uwagę na powiększone terminale procesowe (groty strzałek), które wyglądają jak aksonalne stożki wzrostu. Grubość stosu Z = 220 μm. Pozostałe dwa panele pokazują dwa podstosy tego samego wycinka, z (B) płaszczyznami z 1-30 (grubość z = 59 μm) i (C) 30-120 płaszczyznami z (grubość z = 180 μm). Na górnych płaszczyznach (pokazanych na panelu B), oprócz dużych terminali procesowych i szczątków jak na panelu A, znajdują się mikroglej z niezwykłymi dużymi płaskimi ciałami lub wypukłościami (gwiazdami). Na głębszych płaszczyznach (pokazanych w panelu C) nie ma gruzu ani płaskich obiektów, ale komórki są krzaczaste (strzałki), a gęstość jest niezwykle duża. Podsumowując, obserwacje te wskazują, że mikroglej nie jest w normalnym stanie.