Obrazowanie mikroskopowe neuronów w wycinku mózgu myszy przy użyciu metalicznego barwienia metodą Golgiego-Coxa

Streszczenie

Źródło: Louth, E. L., i inni. Obrazowanie neuronów w grubych odcinkach mózgu metodą Golgiego-Coxa. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje obrazowanie neuronów w grubym fragmencie mózgu zabarwionym metodą Golgiego-Coxa, ustawiając górną i dolną granicę ostrości oraz rejestrując nakładające się obrazy. Obrazowanych jest wiele lokalizacji, aby zapewnić szczegółowe projekcje neuronów, które są łączone w celu stworzenia reprezentacji 3D.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Barwienie

1. Golgiego-CoxaImpregnacja mózgów metodą Golgiego-Coxa
   1. Znieczulenie myszy za pomocą 5% izofluranu.
   2. Uśpij mysz przez ścięcie głowy i szybko usuń mózg.
   3. Umieść mózg w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej 17 ml roztworu Golgiego-Coxa i inkubuj w ciemności w temperaturze RT przez 25 dni.
   4. Cryoprotect mózg, umieszczając go w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml krioprotektantu sacharozy (30% (w/v) sacharozy w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,4) w ciemności w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
      UWAGA: Następujące opcjonalne trzy kroki mogą być zastosowane jako alternatywa dla głównego protokołu, w celu zamrożenia mózgu na tym etapie w celu długoterminowego przechowywania.
   5. Zamroź cały mózg, zanurzając go w 200 ml izopentanu wstępnie schłodzonego na suchym lodzie.
   6. Umieść zamrożony mózg w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przechowuj go w ciemności w temperaturze -80 °C.
   7. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, rozmroź mózg, umieszczając go w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml krioprotektantu sacharozy i trzymając go w ciemności w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
2. Brain Sectioning
   1. Usuń mózg z sacharozy i zablokuj go do podziału, odcinając móżdżek za pomocą żyletki i pozostawiając płaską krawędź na pozostałym ogonowym końcu mózgu.
   2. Podgrzej agar (3% (w/v) w wodzie), aż się rozpuści, a następnie pozwól mu ostygnąć, aż osiągnie nieco wyższą temperaturę topnienia.
   3. Umieść mózg w małym jednorazowym naczyniu do ważenia ogonowym końcem do dołu i dodaj wystarczającą ilość stopionego agaru, aby go przykryć.
   4. Gdy agar zastygnie, przytnij nadmiar agaru, pozostawiając około 2 - 4 mm otaczając mózg, i przyklej mózg do etapu wibratomu z ogonowym końcem skierowanym do dołu, używając niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego etylu.
   5. Wypełnij obszar etapu wibratomu wystarczającą ilością krioprotektantu sacharozy, aby pokryć mózg, a następnie podziel mózg na plasterki o grubości 400 - 500 μm (w zależności od badanego obszaru mózgu) używając częstotliwości wibracji 86 Hz i prędkości posuwu ostrza 0,125 mm/s.
   6. Używając małego pędzla, umieść skrawki mózgu w studzience 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej dostępne na rynku wkładki z siatki i wstępnie wypełnionej 10 ml 6% (w/v) sacharozy w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4.
   7. Inkubuj sekcje w ciemności w temperaturze 4 °C O/N.
3. Developing Brain Sections
   1. Przenieś sekcje mózgu do nowej studzienki zawierającej 5 ml 2% (w/v) paraformaldehydu (PBD) w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4, używając wkładek z siatki. Wysiaduj na bujaku, poruszając się powoli w ciemności przy RT przez 15 minut.
   2. Sekcje powinny być umyte dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających 5 ml wody. Należy je prać na bujaku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności przy natężeniu ruchu przez 5 minut.
   3. Przenieś skrawki do nowej studzienki zawierającej 5 ml 2,7% (v/v) wodorotlenku amonu. Wysiaduj na bujaku, poruszając się powoli w ciemności przy RT przez 15 minut.
   4. Sekcje powinny być umyte dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających 5 ml wody. Należy je prać na bujaku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności przy natężeniu ruchu przez 5 minut.
   5. Przenieś skrawki do nowej studzienki zawierającej 5 ml utrwalacza A rozcieńczonego w wodzie 10x od pierwotnie zakupionego stężenia. Wysiaduj na bujaku, poruszając się powoli w ciemności przy RT przez 25 minut.
   6. Sekcje powinny być umyte dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających 5 ml wody. Należy je prać na bujaku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności przy natężeniu ruchu przez 5 minut.
4. Montaż sekcji mózgu
   1. Za pomocą małego pędzla zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych. Za pomocą pęsety i małej chusteczki usuń nadmiar wody i agaru. Upewnij się, że cały agar został usunięty przed przystąpieniem do odwadniania.
   2. Pozwól sekcjom schnąć na powietrzu w temperaturze RT przez około 45 minut (sekcje 400 μm) lub 90 minut (sekcje 500 μm).
      UWAGA: Czas i właściwy poziom wysuszenia są kluczowe i mogą wymagać określenia w każdym laboratorium w zależności od temperatury i wilgotności otoczenia. Zbyt krótki czas schnięcia prowadzi do odpadania odcinków od szkiełek podczas kolejnych etapów odwadniania, a zbyt długi czas schnięcia prowadzi do pękania sekcji. Sekcje nadal będą wydawać się błyszczące przy odpowiednim poziomie wysuszenia.
   3. Plamić sekcje fioletem krezylowym, umieszczając szkiełka w słoikach do barwienia Coplin, jak wskazano.
      UWAGA: Ten opcjonalny krok może być zastosowany w przypadku sekcji, które nigdy nie zostały zamrożone w celu zabarwienia jąder neuronalnych fioletem krezylowym. Odkryliśmy, że oczyszczanie i ponowne nawadnianie sekcji przed inkubacją w fiołku krezylowym prowadzi do równomiernego zabarwienia i niskiego tła we wszystkich sekcjach.
      1. Umieść w środku czyszczącym na 5 min. Powtórz raz.
      2. Umieść w 100% etanolu na 5 min. Powtórz raz.
      3. Umieść 95% etanolu w wodzie, następnie 75% etanolu w wodzie, a następnie 50% etanolu w wodzie na 2 minuty każde.
      4. Umieść w wodzie na 5 min.
      5. Umieść w 0,5% (w/v) fioletu krezylowego w wodzie na 7 min.
      6. Umieść w wodzie na 2 min. Powtórz raz.
   4. Odwodnij sekcje, umieszczając szkiełka w słoikach do barwienia Coplin, jak wskazano.
      1. Umieść 50% etanolu w wodzie, następnie 75% etanolu w wodzie, a następnie 95% etanolu w wodzie na 2 minuty każde.
      2. Umieść w 100% etanolu na 5 min. Powtórz raz.
      3. Umieścić w środku czyszczącym na 5 min. Powtórz raz.
         UWAGA: Te czasy odwodnienia i oczyszczania są wystarczające do przetworzenia mózgów myszy opisanych w tym manuskrypcie. Zaobserwowaliśmy jednak, że w przypadku innych gatunków, w tym szczurów i krów, końcowy etap oczyszczania może wymagać wydłużenia łącznie do 15 minut.
   5. Przekroje szkiełek nakrywkowych przy użyciu bezwodnego podłoża montażowego.
   6. Pozwól slajdom wyschnąć poziomo w ciemności przy RT przez co najmniej 5 dni.

2. Obrazowanie barwionych neuronów w grubych sekcjach

1. mózguCapture image stacks
   1. Włącz żarówkę mikroskopu, kamerę i kontroler sceny.
   2. Otwórz oprogramowanie mikroskopu (np. Neurolucida).
   3. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu.
   4. Uchwyć szerokokątny obraz 2D sekcji mózgu za pomocą obiektywu o małym powiększeniu, takiego jak 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO lub 4X 0.16 N.A.
      1. Skoncentruj się na obrazie i dostosuj ustawienia aparatu, w tym czas ekspozycji i balans bieli.
      2. Utwórz punkt odniesienia, klikając lewym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu sekcji
      3. Przechwyć obraz, wybierając opcję "uzyskaj pojedynczy obraz" w oknie akwizycji obrazu.
   5. Uchwyć stosy obrazów w średniej rozdzielczości obszaru zawierającego interesujące neurony za pomocą obiektywu 10X 0.3 N.A. UPlan FL N.
      1. Skoncentruj się na obrazie i dostosuj ustawienia aparatu, w tym ekspozycję i balans bieli.
      2. Ustaw górną i dolną granicę stosu obrazów, skupiając się na górze sekcji i wybierając "ustaw" obok "góra stosu" w oknie pozyskiwania obrazu, a następnie skupiając się na dole sekcji i wybierając "ustaw" obok "dolnej części stosu" w oknie akwizycji obrazu.
      3. Ustaw odległość kroku na 5 μm, wpisując "5 μm" obok "odległość między obrazami" w oknie akwizycji obrazu.
      4. Przechwyć stos obrazów, wybierając "zdobądź stos obrazów" w oknie akwizycji obrazu.
      5. Powtórz powyższe kroki, aby uchwycić cały obszar zainteresowania, upewniając się, że wszystkie stosy obrazów nakładają się na siebie o co najmniej 10% w osiach X i Y.
   6. Uchwyć stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości obszaru zawierającego interesujący neuron za pomocą obiektywu 30X 1.05 N.A. z olejem silikonowym.
      1. Nałóż 3 - 4 krople silikonowego olejku immersyjnego na szkiełko i umieść obiektyw nad szkiełkiem, zapewniając kontakt między obiektywem a olejem.
      2. Skoncentruj się na obrazie i dostosuj ustawienia kamery, w tym ekspozycję i balans bieli.
      3. Ustaw górną i dolną granicę stosu obrazów, skupiając się na górze sekcji i wybierając "ustaw" obok "góra stosu" w oknie pozyskiwania obrazu, a następnie skupiając się na dole sekcji i wybierając "ustaw" obok "dolnej części stosu" w oknie akwizycji obrazu.
      4. Ustaw odległość kroku na 1 μm, wpisując "1 μm" obok "odległość między obrazami" w oknie akwizycji obrazu.
      5. Przechwyć stos obrazów, wybierając "zdobądź stos obrazów" w oknie akwizycji obrazu.
      6. Powtórz powyższe kroki, aby uchwycić cały obszar zainteresowania, upewniając się, że wszystkie stosy obrazów nakładają się na siebie o co najmniej 10% w osiach X i Y.
   7. Zapisz plik danych i wszystkie pliki graficzne w formacie TIFF do zewnętrznego przetwarzania.
2. Tworzenie obrazów projekcji Z i montaży obrazów
   1. Create Z-projection images in ImageJ
      1. Otwórz oprogramowanie ImageJ, które ma zainstalowaną wtyczkę Bio-Formats.
      2. Wybierz "Wtyczki" -> "Bio-formaty" -> "Importer Bio-Formatów."
      3. Wybierz plik stosu obrazów, który chcesz otworzyć.
      4. Po otwarciu pliku zmień format na RGB, wybierając "Obraz" -> "Typ" -> "Kolor RGB".
      5. Utwórz projekcję Z, wybierając "Obraz" -> "Stosy" -> "Projekt Z...".
      6. Zapisz dwuwymiarowy obraz projekcji Z jako plik TIFF.
   2. Stwórz dwuwymiarowy montaż obrazu całego obszaru zainteresowania.
      1. Otwórz oprogramowanie (np. Adobe Photoshop).
      2. Wybierz "Plik" -> "Automatyzuj" -> "Photomerge".
      3. Wybierz "Przeglądaj", a następnie dodaj wszystkie pliki graficzne do scalenia.
      4. Upewnij się, że zaznaczona jest opcja "Blend Images", a następnie wybierz "OK".
      5. Zapisz wynikowy obraz montażowy całego obszaru zainteresowania jako plik TIFF.

Materiały