Obrazowanie aktywacji neuronów hipokampa w sekcjach mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Provenzano, G., i wsp. Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film przedstawia obrazowanie immunohistochemiczne w celu wizualizacji aktywacji neuronów hipokampa. Poplamione skrawki mózgu ujawniają ciemniejsze obszary pod mikroskopem jasnego pola, co wskazuje na aktywowane neurony.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Immunohistochemia

1. Przenieś 3-5 grzbietowych odcinków hipokampa dla każdej myszy do 24 wielodołkowych płytek zawierających 500 μl 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) dla każdej studzienki.
2. Skrawki znajdujące się w każdej studzience przemyć 500 μl 0,1 M PBS (5 min, 3 razy delikatnie wstrząsając).
3. Stłumić endogenną aktywność peroksydazy przez inkubację skrawków w 1% nadtlenku wodoru (H₂O₂) w PBS przez 20 minut z delikatnym mieszaniem.
4. Umyć sekcje w 0,1 M PBS z delikatnym mieszaniem (3 x 5 min).
5. Permeabilizacja tkanek: inkubować skrawki przez 5 minut w 0,2% Triton X-100 w PBS.
6. Podczas powyższych kroków (1.4; 1.5) należy przygotować wystarczającą ilość buforu blokującego (10% Koziej Surowicy i 0,1% Triton-X100 w PBS) na cały eksperyment (liczba sekcji x 100 μl x 3 kroki).
7. UWAGA: Użyj surowicy tego samego gatunku, w której wyprodukowano przeciwciało drugorzędowe (Ab) (sprzężone z biotyną).
8. Zapobiegać niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała poprzez inkubację skrawków w buforze blokującym (100 μl/sekcję) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym mieszaniem.
9. Inkubować skrawki w pierwotnej fosforylowanej kinazie regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym Ab (pERK) rozcieńczoną w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C, z delikatnym mieszaniem.
10. Umyć sekcje w 0,1 M PBS z delikatnym mieszaniem (3 x 5 min).
11. Inkubować z drugorzędowym Ab sprzężonym z biotyną (1:250) rozcieńczonym w buforze blokującym (takim samym, jak użytym w kroku 1.6) przez 1 godzinę w temperaturze słonecznej z delikatnym mieszaniem.
12. Przygotuj odczynnik kompleksu awidyna-biotyna (ABC) w tym samym czasie, ponieważ awidyna i biotyna wymagają co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej do stworzenia.
13. Przygotuj wymaganą objętość odczynnika ABC zgodnie z protokołem producenta.
14. Umyć sekcje w 0,1 M PBS z delikatnym mieszaniem (3 x 5 min).
15. Inkubować sekcje przez 45 minut w temperaturze pokojowej z odczynnikiem ABC.
16. Umyć sekcje w 0,1 M PBS z delikatnym mieszaniem (3 x 5 min).
17. Aby przygotować roztwór roboczy diaminobenzydyny (DAB), każdy etap związany z DAB musi być wykonany w dygestorium, ponieważ DAB jest rakotwórczy i teratogenny.
18. Przenieś roztwór DAB na nową płytkę za pomocą plastikowej pipety transferowej.
19. Umieść sekcje w płytce zawierającej roztwór roboczy DAB i powoli obracaj płytkę ręcznie, aby umożliwić maksymalne naświetlenie sekcji.
20. Monitoruj reakcję DAB pod mikroskopem, aż do uzyskania odpowiedniego sygnału (2-5 min).
21. Zatrzymaj reakcję przy pożądanej intensywności koloru, przemywając tkankę w 0,1 M PBS (3 x 5 min).
22. Użyj wybielacza, aby dezaktywować pozostały roztwór substratu DAB w dygestorium na noc i zutylizować go zgodnie z wytycznymi laboratoryjnymi.
23. Zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną, pływając nimi w PBS. Następnie susz je w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3-4 godziny.
24. Odwodnić skrawki kolejno w 50%, 70%, 95% i 100% etanolu przez 2 minuty każdy i oczyścić w 100% ksylenie przez 5 minut.
25. Szkiełko nakrywkowe za pomocą podłoża montażowego i pozostaw na noc w dygestorii do wyschnięcia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% etanolu	Fisher Scientific	A406-20	Służy do wytwarzania gradientu etanolu do odwodnienia przed montażem zjeżdżalni.
Xylene	VWR	66004-950	Toksyczny - do stosowania pod maską. Zmieniaj ksylen co miesiąc w zależności od zastosowania.
PBS	Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
Nadtlenek wodoru	Sigma	H1009-100ML
Normalna surowica kozia	Abcam	G9023-10ML
zestaw ABC Vectastain	Laboratoria wektorowe	PK-6100	Dodać objętość 5 ml PBS 2 krople odczynnika A, wymieszać, a następnie dodać 2 krople odczynnika B i wymieszać.
Podłoże peroksydazy DAB	Vector Laboratories	SK-4100	Dodaj objętość 5 ml podwójnie destylowanej wody: 2 krople buforowego roztworu podstawowego i wymieszaj; 4 krople DAB i wymieszaj; 2 krople nadtlenku wodoru i wymieszaj.
przeciwciało pERK	Technologie sygnalizacji komórkowej	4370	Rozcieńczenie 1:500
Biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze IgG	Laboratoria Wektorowe	BA-1000	Rozcieńczenie 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Szkiełka nakrywkowe	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Medium montażowe do prowadnic. Można użyć równoważnego medium montażowego.