Obrazowanie wewnątrzkomórkowej dynamiki ATP za pomocą czujników opartych na FRET w organotypowym wycinku hipokampa myszy

Streszczenie

Źródło: Lerchundi, R., et. al. Obrazowanie wewnątrzkomórkowego ATP w organotypowych wycinkach tkanki mózgu myszy przy użyciu czujnika ATeam1.03YEMK opartego na FRET. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje wykorzystanie czujników opartych na FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów ATP w organotypowych wycinkach hipokampa myszy, umożliwiając wizualizację dynamiki ATP w neuronach i astrocytach w czasie rzeczywistym w warunkach fizjologicznych i eksperymentalnych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Obrazowanie ATP oparte na FRET (Rysunek 1)

1. Przed eksperymentem przygotuj E-ACSF i bąbelkuj go 95% O₂/5% CO₂ przez co najmniej 30 minut, aby uzyskać pH 7,4. Włącz fluorescencyjne źródło światła (lampę ksenonową) monochromatora (Rysunek 1). Rozpocznij perfuzję tuż przed wyjęciem plastra z inkubatora.
   UWAGA: Utrzymuj sól fizjologiczną z 95% O₂ i 5% CO₂ podczas całego eksperymentu.
2. Przenieś plaster do komory doświadczalnej, która jest stale perfundowana świeżo karbogenicznym E-ACSF za pomocą pompy perystaltycznej (Rysunek 1). Następnie przymocuj plasterek za pomocą siatki. Umieść komorę na stoliku mikroskopu i podłącz system perfuzyjny. Do perfuzji zalecane są gazoszczelne rurki laboratoryjne.
   UWAGA: Eksperymenty mogą być przeprowadzane w temperaturze pokojowej lub zbliżonej do temperatury fizjologicznej, w zależności od projektu eksperymentu. Sprawdź stabilność i niezawodność przepływu perfuzyjnego, aby uniknąć zmian ogniska wywołanych ruchem tkanki i/lub zmianami naprężeń ścinających. Standardowe prędkości perfuzji do pracy z plastrami, używane przez nas i wiele innych laboratoriów, wynoszą 1,5-2,5 ml/min.
3. Ustaw ostrość wyhodowanego plastra za pomocą światła transmisyjnego. Zidentyfikuj obszar, w którym należy przeprowadzić eksperymenty (na przykład: region CA1 hipokampa). Przed rozpoczęciem eksperymentów obrazowych należy odczekać co najmniej 15 minut, aby plastry przystosowały się do warunków zasolenia. Aby zapoznać się z konfiguracją konfiguracji eksperymentalnej, zobacz Rysunek 1.
4. Włącz aparat i oprogramowanie do obrazowania. Następnie wybierz odpowiednią kostkę filtrującą.
5. Wzbudzić białko fluorescencyjne donora (eCFP) przy 435/17 nm (~435 nm). Ustaw czas ekspozycji od 40 do 90 ms.
   UWAGA: Silna ekspozycja plastrów na światło fluorescencyjne może powodować efekty fototoksyczne.
6. Wzbudzenie przy długości fali 435 nm powoduje emisję zarówno przy długości fali 475 nm (eCFP; dawca), jak i 527 nm (Wenus; akceptor). Podziel emisję fluorescencji przy 500 nm za pomocą rozdzielacza obrazu emisyjnego i zastosuj filtry pasmowoprzepustowe przy 483/32 i 542/27, aby dalej wyizolować fluorescencję donorową i akceptorową. Silna ekspresja może skutkować nasyceniem detektorów. W takim przypadku można użyć filtra o neutralnej gęstości, aby zmniejszyć intensywność wzbudzenia.
7. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) pozornie pozbawiony fluorescencji komórkowej do odejmowania tła. Następnie utwórz ROI wyznaczające ciała komórek.
8. Ustaw częstotliwość przechwytywania obrazu i całkowity czas nagrywania. W przypadku długich (>30 min) eksperymentów zaleca się częstotliwość akwizycji 0,2-0,5 Hz, aby zapobiec fototoksyczności.
9. Rozpocznij nagrywanie. Zaleca się rejestrowanie co najmniej 5 minut w warunkach wyjściowych w celu zapewnienia stabilności preparatu.
   UWAGA: Dostosuj ostrość komórki podczas nagrywania, jeśli to konieczne.

Wyniki

Rysunek 1: Konfiguracja konfiguracji obrazowania FRET. (A) Schematyczne ilustracje różnych komponentów i ich rozmieszczenia przestrzennego wymaganego w konfiguracji obrazowania FR...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-deoksyglukoza	Alfa Aesar	L07338	Niemetabolizowalny analog
Filtry przepustowe 483/32	AHF Analysentechnik AG		Filtr
Filtry pasmowe 542/27	AHF Analysentechnik AG		Filtr emmisyjny kompatybilny z rozdzielaczem
Rozdzielacz wiązki T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		Excitation dichroic mirror
Beamsplitter T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		Splitter dichroic
Przetwarzanie danych Origin Pro 9.0.0 (64- bit)	OriginLab corporation		Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych<
Caelo	2580-1kg		DPBS	GIBCO/Życie
14190250	Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco
Mikroskop pionowy Eclipse E 600FN	Nikon Microscope Solutions			Mikroskop pionowy Eclipse FN1	Rozwiązania mikroskopowe Nikon
komora eksperymentalna	custom build		Komora perfuzyjna do obrazowania
Hanks' Zrównoważony roztwór soli	Sigma-Aldrich	H9394	Z czerwienią fenolową do monitorowania
Minimum Niezbędne średnie orzeł	Sigma-Aldrich	M7278	Syntetyczne podłoża
Monochromator Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		Ultra szybki Przełączanie monochromatora
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		Obiektyw
Zaawansowane badania NIS Elements 4.50	Nikon Microscope Solutions		Oprogramowanie do obrazowania. Ulepszona wersja do obrazowania FRET
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		Cyfrowa kamera CMOS	Rurki perfuzyjne	Pro Liquid GmbH		Rurka Tygon, 1,52 x 322 mm (szer.: 0,85);
Photoshop CS 6 wersja 13.0	Adobe		Oprogramowanie
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	Jednoniciowy wektor AAV, który indukuje ekspresję ATeam1.03YEMK pod kontrolą ludzkiego fragmentu promotora synapsyny 1 hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	Jednoniciowy wektor AAV, który indukuje ekspresję ATeam1.03YEMK pod kontrolą ludzkiego fragmentu promotora fibrylarnego białka glejowego ABC1D.

glukozy emmisyjny kompatybilny z rozdzielaczemtd style='wysokość:14.5pt;szerokość:204pt;'>D-glukoza monohydrate żywych komórek pH do hodowli komórkowych mikroskopu wodnego do przetwarzania obrazów