Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej za pomocą implantu czaszki

Streszczenie

Źródło: Bisht, K., et al. Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne dynamiki neuroimmunologicznej u transgenicznej myszy z implantem czaszki. Stabilność naczyniowa i neuronalna jest obrazowana wraz z dynamicznymi zmianami mikrogleju, odzwierciedlającymi odpowiedzi immunologiczne na aktywność neuronów.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie myszy do implantacji okna czaszkowego

UWAGA: Różne transgeniczne linie myszy ze znacznikami fluorescencyjnymi nadają się do obrazowania.

1. Użyj myszy CX3CR1GFP/+ do wizualizacji mikrogleju in vivo. Zazwyczaj stosuje się młode i młode dorosłe myszy w wieku od 4 do 10 tygodni o wadze 17-25 g.
   UWAGA: Chociaż to podejście jest odpowiednie nawet dla myszy przed odsadzeniem, konieczność powrotu myszy do ich klatek z matkami w celu karmienia może skomplikować powrót do zdrowia, jeśli matka nie zadba odpowiednio o młode po operacji. Dlatego zaleca się stosowanie myszy po odsadzeniu.
2. Znieczulij mysz za pomocą izofluranu (5% przepływu tlenu do indukcji przez 1 min) w komorze anestezjologicznej. Sprawdź, czy mysz nie wykazuje żadnych ruchów ani drgań na szczypanie palców i/lub ogona. Wyjmij mysz z komory i na świeżym powietrzu dokładnie ogol włosy na głowie między uszami od mniej więcej poziomu oczu do górnej części szyi za pomocą trymera do włosów.
   UWAGA: Stężenie użytego izofluranu zależałoby od wielkości komory indukcyjnej. Dlatego w przypadku mniejszych komór można zastosować 3-4% izofluranu w celu skutecznego wywołania znieczulenia, podczas gdy większe komory będą wymagały do 5%.
3. Przesuń mysz na stożek nosowy stereotaktycznego stanowiska chirurgicznego w celu znieczulenia (1,5-2% do konserwacji podczas operacji), ustabilizuj głowę za pomocą pasków nausznych i trzymaj mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała w cieple.
4. Nasmaruj oba oczy maścią do oczu. Wstrzyknąć 100 μl 0,25% bupiwakainy (w celu zapewnienia myszu miejscowego znieczulenia, które będzie trwało 8-12 godzin) i 100 μl 4 mg/ml deksametazonu (w celu zmniejszenia stanu zapalnego, który może wynikać z zabiegu chirurgicznego) podskórnie w miejsce nacięcia. Pozwól myszy siedzieć przez co najmniej 5 minut przed przejściem do następnego kroku.
5. Oczyść ogoloną głowę trzema naprzemiennymi wacikami z betadyną i 70% alkoholem. Za pomocą ostrza chirurgicznego lub nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy rozciągające się od tylnej części czaszki między uszami do przedniej części między oczami. Pozostała skóra jest cięta w celu odsłonięcia czaszki.
6. Oczyść tkankę łączną znajdującą się między skórą głowy a leżącą pod nią czaszką za pomocą 3% nadtlenku wodoru (H₂O₂) i zlokalizuj obszar mózgu, który ma być obrazowany, za pomocą współrzędnych stereotaktycznych.
   UWAGA: Często występuje krwawienie (krok 1.5) z nacięcia na powierzchni czaszki. Krwawienie to zwykle ustępuje samoistnie w ciągu 3-5 minut. Pomaga czyszczenie nadtlenkiem. Zauważono również, że wcześniejsze leczenie bupiwakainą (etap 1.4) ogranicza ilość krwawień w tym czasie.

2. Operacja implantacji okna czaszkowego u myszy

1. Wywierć okrągły otwór ~4 mm w czaszce za pomocą wiertła dentystycznego (średnica końcówki 0,7 mm) i ostrożnie usuń tę część czaszki za pomocą spiczastych kleszczy. Aby zobrazować korę somatosensoryczną myszy w wieku 6-8 tygodni, zlokalizuj środek kraniotomii na -2,5 tylnej i ± 2,0 bocznej do bregmy. Podczas wiercenia regularnie zwilżaj czaszkę sterylną solą fizjologiczną i wacikami, aby schłodzić mózg, oczyścić resztki kości kostnej i zmiękczyć kość czaszki w celu ewentualnego usunięcia.
   UWAGA: Współrzędne kraniotomii różnią się w zależności od regionu zainteresowania i wieku myszy.
2. Po wyjęciu czaszki ostrożnie umieść małe szkło nakrywkowe (rozmiar #0 o grubości 0,1 ± 0,02 mm) zwilżone solą fizjologiczną w kraniotomii. Osusz nadmiar soli fizjologicznej za pomocą sterylnej chusteczki.
3. Za pomocą spiczastego aplikatora (takiego jak końcówka pipety lub spiczasty koniec złamanego drewnianego patyczka do wacików) nałóż klej cyjanoakrylowy wokół okna i pozwól mu przyczepić się do mózgu i czaszki. Nałóż klej podkładowy na resztę czaszki i utwardź go światłem utwardzającym przez 20-40 s. Przygotuj studzienkę wokół okna z końcowym klejem i utwardź światłem utwardzającym 20-40 s.
4. Przyklej małą płytkę głowy do czaszki na przeciwległej półkuli kraniotomii najpierw za pomocą kleju podkładowego jako podkładu, a następnie za pomocą końcowego kleju. Utwardź oba lampą utwardzającą przez 20-40 s każdy.
   UWAGA: Szwy są niepotrzebne, jeśli czaszka jest pokryta klejem podczas tego zabiegu.

3. Opieka pooperacyjna

1. Pozwól myszy obudzić się bez znieczulenia (rekonwalescencja wykonana na poduszce grzewczej skraca czas rekonwalescencji) i wróć do klatki domowej, gdy w pełni się obudzi. Wstrzyknąć jedną podskórną dawkę buprenorfiny SR (0,5 mg/kg) jako znieczulenie pooperacyjne, które wystarcza na 72 godziny.
2. Aby ułatwić zdrowy powrót do zdrowia po operacji, podawaj myszy wyjątkowo miękki pokarm, taki jak zwykła karma nasączona wodą w celu zmiękczenia lub karma w postaci żelu.
   UWAGA: Jednorazowe podanie miękkiego jedzenia bezpośrednio po operacji jest wystarczające.
3. Codziennie monitoruj mysz pod kątem zdrowia i prawidłowej rekonwalescencji przez pierwsze 72 godziny zabiegu chirurgicznego. Następnie obrazowanie z operacji implantacji okiennej zostanie wykonane już po 2 tygodniach.
   UWAGA: Jeśli zostanie to zrobione dobrze, myszy dobrze się regenerują, wykazując normalne zachowania ambulatoryjne, wystarczającą eksplorację klatki, dobre nawodnienie, stabilny przyrost masy ciała i rozległe interakcje z innymi myszami w klatce i innymi przedmiotami w klatce. Myszy wykazujące letarg, odwodnienie i utratę masy ciała większą niż 10% po operacji są poddawane eutanazji i usuwane z badania.

4. Dwufotonowe mapowanie mózgu do wstępnego obrazowania

1. Znieczulenie myszy (izofluran, 5% indukcji i 1,5% konserwacji). Ustabilizować głowicę za pomocą śrub, aby zamontować płytkę głowicy na stoliku mikroskopu dwufotonowego, utrzymywanym na płycie grzewczej w temperaturze 35 °C. Wstrzyknąć dootrzewnowo 100 μl barwnika do naczyń krwionośnych, takiego jak rodamina B (2 mg/ml).
   UWAGA: Obrazowanie można również wykonać u obudzonych myszy bez znieczulenia. Jednak ostatnie badania wskazują, że znieczulenie wpływa na dynamikę nadzoru mikrogleju. Fiksacja głowy do obrazowania dwufotonowego u obudzonych myszy zwiększa stres nawet podczas przewlekłego obrazowania przez co najmniej 25 dni.
2. Delikatnie wyczyść powierzchnię okienka czaszki za pomocą bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem. Nałóż kilka kropel wody lub soli fizjologicznej na okienko czaszki i opuść soczewkę obiektywu do roztworu, ponieważ obiektyw jest soczewką zanurzeniową.
3. Ręcznie narysuj zgrubną mapę, aby oznaczyć główne punkty orientacyjne naczyń krwionośnych w zeszycie laboratoryjnym, patrząc przez okular za pomocą epifluorescencji. Użyj tego rysunku, aby zidentyfikować określone obszary podczas obrazowania dwufotonowego. Alternatywnie, zrób zdjęcia naczyń krwionośnych za pomocą kamery zamontowanej w mikroskopie lub za pomocą ręcznego aparatu lub telefonu.
   UWAGA: Te ręcznie rysowane obrazy i obrazki mają ułatwić ponowne przyjrzenie się tym samym szerokim obszarom pod mikroskopem przed obrazowaniem dwoma fotonami. Nie jest to precyzyjne odwzorowanie obrazu.
4. W ramach obrazowania dwoma fotonami zbierz obrazy komórek fluorescencyjnych i naczyń krwionośnych w razie potrzeby. Rób dokładne notatki z odpowiednimi współrzędnymi, aby upewnić się, że dokładne obszary mogą zostać ponownie odwiedzone w celu późniejszego obrazowania. Zbierz kilka pól widzenia podczas tej początkowej sesji obrazowania, np. uzyskuj obrazy stosu z co 1-2 μm przez objętość tkanki.
   UWAGA: Podczas zbierania obrazów za pomocą dwóch fotonów, punkty orientacyjne naczyń krwionośnych są używane do zgrubnego mapowania. Jeśli potrzebne jest dokładne mapowanie, stosuje się dendryty znakowane YFP z myszy Thy1-YFP.
   1. Do obrazowania należy stosować następujące zalecane parametry: optymalna jest długość fali 880-900 nm; do wzbudzenia GFP i/lub dsRed/rodaminy stosuje się zwierciadło dichroiczne 565 nm z filtrami emisji 525/50 nm (kanał zielony) i 620/60 nm (kanał czerwony); do separacji GFP i YFP stosuje się zwierciadło dichroiczne 509 nm z filtrami emisyjnymi 500/15 i 537/26 nm; moc w mózgu jest utrzymywana na poziomie 25 mW lub niższym; rozdzielczość obrazu wynosi 1024 x 1024 pikseli, pole widzenia wykonane obiektywem 25X 0,9 NA przy współczynniku powiększenia 1,5X wynosi 295,24 x 295,24 μm.
5. Na koniec obrazowania zdejmij mysz ze sceny, pozwól jej wybudzić się z narkozy i wrócić do swojej domowej klatki do czasu przyszłej sesji obrazowania.

5. Obrazowanie dwufotonowe i ponowne obrazowanie

1. W przypadku przyszłych kolejnych sesji obrazowania, które mogą trwać od kilku godzin do miesięcy po początkowej sesji obrazowania, znieczulij mysz (izofluran, 5% indukcji i 1,5% konserwacji), zamontuj na mikroskopie dwufotonowym, utrzymuj na płycie grzewczej i ponownie wstrzyknij 100 μl barwnika do naczyń krwionośnych, takiego jak rodamina B (2 mg / ml).
2. Otwórz wcześniej uzyskane obrazy w ImageJ i korzystając z tych obrazów, a także notatek z poprzedniej sesji, zidentyfikuj poprzednio zobrazowane obszary i ostrożnie zobrazuj je ponownie.
3. Powtarzaj tę czynność tak długo, jak długo okienko obrazowania jest wyraźne lub jest to niezbędne dla zakresu badania.

Materiały

https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkło nakrywkowe (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Klej cyjanoakrylowy (Krazy Glue)	Amazon<
System utwardzania LED Demi Ultra	Dental Health Products, Inc	910860-1
Wiertło dentystyczne	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Wiertło	Fine Science Tools	#19008-07
maść do oczu	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (klej podkładowy)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Klej Tetris Evoflow (klej końcowy)	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon<

td style='width:186pt;'>td style='szerokość:186pt;'>