Obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych w przeponie transgenicznej myszy

Streszczenie

Źródło: Heredia, D. J., et. al. Obrazowanie ex vivo specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne dynamiki wapnia w połączeniach nerwowo-mięśniowych (NMJ) u transgenicznej myszy wykazującej ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. NJM jest identyfikowany przez fluorescencyjnie znakowane receptory acetylocholiny w przeponie z nerwem przeponowym . Rozdzielacz obrazu służy do jednoczesnej wizualizacji wielu sygnałów. Dostarczany jest bodziec elektryczny i rejestrowana jest zmiana fluorescencji w NMJ w odpowiedzi na napływ wapnia.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie przepony i nerwów przeponowych od myszy transgenicznych

1. Kup myszy transgeniczne i startery oligonukleotydowe do genotypowania tych myszy.
   1. Wyhoduj mysz w wieku od 3 do 6 miesięcy z ekspresją jednej kopii odpowiedniego transgenicznego/knock-in allelu Cre-driver i zerowymi kopiami warunkowego allelu GCaMP3/6 z drugą myszą w tym samym wieku z ekspresją jednej lub dwóch kopii warunkowego allelu GCaMP3/6 i zerowymi kopiami allelu Cre-driver.
   2. Genotyp szczeniąt i oznaczanie tych zarówno allelami Cre, jak i warunkowymi allelami GCaMP3/6 - będą one odtąd nazywane myszami podwójnie transgenicznymi (np. Myf5-Cre, warunkowy GCaMP3).
      Uwaga: W ten sposób wszystkie dane będą pochodzić od myszy wyrażających jedną kopię zarówno alleli Cre, jak i warunkowych GCaMP3/6. Jest to szczególnie ważne przy dodawaniu innych zmutowanych myszy (np. nokautów) do tych krzyżówek.
2. Gdy podwójnie transgeniczne myszy są w odpowiednim wieku (np. 0 lub 5 dzień po urodzeniu [P0 lub P5] lub dorosły), należy poddać myszy eutanazji poprzez ścięcie im głów nożyczkami (dla myszy młodszych niż P10) lub umieszczenie ich w komorze inhalacyjnej izofluranu. Kiedy nie reagują już na szczypanie ogona parą kleszczy, są gotowe do poświęcenia.
3. Poświęć zwierzę przez ścięcie nożyczkami.
4. Przekrój poprzeczny w poprzek całego zwierzęcia tuż pod wątrobą i tuż nad sercem i płucami za pomocą nożyczek do irydektomii.
5. Wypreparuj wątrobę, serce i płuca, uważając, aby utrzymać długość nerwu przeponowego, która jest wystarczająco długa, aby można ją było wciągnąć do elektrody ssącej (tj. 1-2 cm).
   Uwaga: Lewy nerw przeponowy można zidentyfikować jako biały fragment tkanki, który wchodzi do przyśrodkowej części lewej przepony. Nie wolno go przecinać podczas usuwania płuc. Prawy nerw przeponowy biegnie w kawałku powięzi, który zawiera również żyłę główną górną i jest cieńszy i bielszy niż żyła główna. Razem oba przenikają do prawej przepony przyśrodkowej.
6. Następnie usuń klatkę piersiową i kręgosłup, z wyjątkiem cienkiego grzbietu wokół przepony.
7. Umieść przeponę i próbkę nerwu przeponowego w probówce do mikrofuge z roztworem Krebsa-Ringera z 1 μg/ml 594-αBTX na 10 minut w ciemności.
   Uwaga: To stężenie 594-αBTX oznacza receptory acetylocholiny (AChR) bez blokowania ich funkcji (obserwacja osobista).

2. Stymulacja i rejestracja potencjałów czynnościowych mięśni

1. Za pomocą szpilek minutien unieruchomić membranę, przypinając ją do 6-centymetrowego naczynia pokrytego silikonowym żelem dielektrycznym i wypełnionego ~8 ml natlenionego roztworu Krebsa-Ringera i umieścić na stoliku mikroskopowym. Ukrwić membranę większą ilością roztworu Krebsa-Ringera (8 ml/min) przez 30 minut.
   Uwaga: To wypłukuje niezwiązany 594-αBTX, a także równoważy tkankę po rozwarstwieniu.
2. Wykonaj elektrodę ssącą zgodnie z ustalonymi metodami.
   1. Przy 4-krotnym powiększeniu, za pomocą mikromanipulatora, przesuń elektrodę ssącą nad lewym nerwem przeponowym i zastosuj ssanie, wyciągając cylinder strzykawki o pojemności 5 ml podłączonej do rurki przymocowanej do elektrody ssącej.
      Uwaga: Po pomyślnym wciągnięciu do elektrody ssącej nerw przeponowy jest napięty. Włącz stymulator i stymuluj nerw przeponowy, przestawiając przełącznik ręczny 1x.
   2. Upewnij się, że membrana kurczy się w odpowiedzi na stymulację 1 Hz, badając ją wzrokowo za pomocą oświetlenia jasnego pola. Jeśli nie, wyreguluj napięcie, stopniowo obracając pokrętło napięcia, aby uzyskać impuls supramaksymalny, który można zweryfikować za pomocą wizualnego badania skurczu mięśni. Jeśli nadal nie jest widoczny, przedmuchaj nerw strzykawką i spróbuj wciągnąć go ponownie, odsysając.
3. Wyłącz perfuzję i dodaj specyficzny dla mięśni inhibitor miozyny BHC6 lub bramkowanego napięciem antagonistę kanału sodowego μ-konotoksynę8 do końcowego stężenia 100 μM.
   1. Aby uzyskać 100 μM BHC, odpipetuj 4 μl z 200 mM zapasu w DMSO i wstępnie rozcieńcz w 1 ml roztworu Krebsa-Ringera.
   2. Usuń 1 ml roztworu Krebsa-Ringera z naczynia.
   3. Dodaj wstępnie rozcieńczony BHC do naczynia.
      Uwaga: To wstępne rozcieńczenie pomaga zapobiec indukcji przez nierozcieńczony DMSO nieprzejściowej odpowiedzi fluorescencyjnej w komórkach eksprymujących GCaMP3.
   4. Odczekaj 30 minut, a następnie włącz perfuzję świeżego roztworu Krebsa-Ringera na kolejne 20 - 30 minut.
4. Przygotuj elektrodę rejestrującą.
   1. Zakładając rękawice, umieść szkło z włókna borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej (OD) 1 mm i średnicy wewnętrznej (ID) 0,4 mm w ściągaczu do mikropipet, dokręć pokrętła, aby clamp na miejscu, i zamknij drzwiczki ściągacza.
   2. Za pomocą ściągacza P-97 zaprogramuj następujące ustawienia: ciepło na 900, ciąg na 120, prędkość na 75, czas na 250, ciśnienie na 500 i brak dodatkowych pętli.
      Uwaga: Rezystancja (R) jest mierzona za pomocą oprogramowania sterującego wzmacniacza: oprogramowanie do akwizycji danych potwierdza rezystancję, rozwiązując wzór V = IR. Sterownik programowy przepuszcza znany prąd (I) (zwykle 1 nA) przez elektrodę i mierzy zmianę napięcia (V), umożliwiając nam w ten sposób rozwiązanie dla R.
   3. W przypadku membran embrionalnych upewnij się, że rezystancja jest bliska 60 MΩ, a w przypadku starszych membran, 10 - 20 MΩ. Załaduj elektrodę rejestrującą 3 M chlorkiem satu (KCl).
5. Przy 10-krotnym powiększeniu opuść elektrodę do mięśnia, używając drugiego mikromanipulatora po przeciwnej stronie stolika jako elektrody stymulującej.
6. Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych, poczekaj, aż spoczynkowy potencjał błonowy zmieni się z 0 na -65 mV lub poniżej.
7. Stymulować przy 1 Hz i sprawdzić obecność potencjału czynnościowego mięśni, sprawdzając, czy istnieje duży potencjał, który wykazuje umiarkowane przeregulowanie (potencjał, który wzrasta powyżej 0 mV, gdy zaczyna się od -65 mV lub poniżej). Nie należy mylić artefaktu stymulacji z potencjałem czynnościowym.
   Uwaga: Potencjały są znacznie dłuższe w czasie trwania (~5 ms) niż artefakty stymulacji.

3. Obrazowanie fluorescencji próbki

1. Przy 20-krotnym powiększeniu zlokalizuj pasmo płytki końcowej w środku mięśnia, szukając połączeń nerwowo-mięśniowych znakowanych 594-αBTX lub NMJ pod wzbudzeniem światłem zielono-żółtym (550 nm). Przełącz się na wzbudzenie światłem niebieskim (470 nm), aby zobrazować odpowiedzi Ca²⁺ w mięśniach, neuronach ruchowych lub komórkach Schwanna.
2. W razie potrzeby skonfiguruj rozdzielacz obrazu z filtrami pasmowoprzepustowymi i dichroicznym filtrem jednokrawędziowym do obrazowania o podwójnej długości fali.
3. Aby obliczyć maksymalną fluorescencję (Fmax) wykazywaną przez tkankę wykazującą ekspresję GCaMP3/6, należy dodać 12 μl 3 M chlorku potasu (KCl) do preparatów diafragmy.
   1. Wykonuj eksperymenty z paskiem jasności na pasku tabeli przeglądowej ustawionym na 110% poziomu, przy którym tkanka wykazująca ekspresję GCaMP3/6 wykazuje nasycenie przy 20-krotnym powiększeniu bez kategoryzacji w odpowiedzi na KCl.
4. Nagrywaj z prędkością 20 klatek na sekundę, aby nie przegapić żadnych szybkich wydarzeń.
5. Stymulować stymulacją nerwów przez 1 - 45 s 20 - 40 Hz, dostarczając ciąg impulsów za pomocą elektrody ssącej lub dodać farmakologicznych agonistów przez kąpiel lub perfuzję i zebrać dynamiczne fluorescencyjne Ca²⁺ w jednym podtypie komórki wraz ze statycznym sygnałem NMJ 594-αBTX.
   Uwaga: Jeśli specyficzne tkankowo czerwone lub dalece czerwone genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) lub genetycznie kodowane wskaźniki napięcia (GEVI) staną się dostępne do użytku w NMJ, można je wykorzystać do zebrania dwóch dynamicznych sygnałów odzwierciedlających dwa odrębne elementy komórkowe w NMJ.
6. Po zakończeniu obrazowania lub eksperymentów elektrofizjologicznych, ponieważ osiągnięto pożądane wyniki, należy przepuścić wodę przez linie perfuzyjne i zassać wodę 2x - 3x przez elektrodę ssącą, aby upewnić się, że sole nie gromadzą się.

Materiały