Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Przygotowanie i montaż oczyszczonej tkanki

1. Gdy próbka zakończy oczyszczanie i będzie wystarczająco klarowna, umyj ją w PBS przez noc w temperaturze pokojowej. Wymieniaj PBS na nowy PBS tak często, jak to możliwe. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla usunięcia resztkowych SDS, które mogą tworzyć osady w późniejszych krokach.
2. Po ostatnim umyciu w PBS myj chusteczkę przez 5 minut w wodzie dejonizowanej o temperaturze pokojowej trzy razy. Na tym etapie tkanka stanie się nieprzezroczysta i może się rozszerzyć.
3. Inkubować tkankę w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła (patrz Tabela 1) przez co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej. Rysunek 1B{ przedstawia fragment oczyszczonej tkanki po inkubacji w roztworze o dopasowaniu współczynnika załamania światła.
4. Podczas inkubacji tkanki w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła należy skonstruować odpowiednią komorę do obrazowania próbki, jeśli to konieczne.
5. Budowa komory obrazowania dla małych próbek/plastrów tkanek
   1. Używając szkiełka jako podstawy do montażu, połóż gumowe lub plastikowe przekładki i zabezpiecz super klejem. Jeśli gotowe przekładki nie są dostępne, użyj plastikowych pierścieni wykonanych ze stożkowych przekrojów rur.
   2. Upewnij się, że te elementy są przymocowane do szkiełka bez żadnych otworów (Rysunek 1C).
   3. Umieść oczyszczoną tkankę w komorze montażowej wstępnie wypełnionej roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła.
   4. Bezpiecznie zamocuj chusteczkę, umieszczając na niej szklane szkiełko nakrywkowe i uszczelniając je lakierem do paznokci.
   5. Zobrazuj tę tkankę, dodając kroplę roztworu montażowego pasującego do współczynnika załamania światła bezpośrednio na powierzchni szkła.
6. Duża komora do obrazowania tkanek
   1. Zbuduj tę komorę, jeśli tkanka ma grubość większą niż 5 mm (odpowiednia dla całych mózgów lub półkul).
   2. Używając szklanego naczynia o średnicy 10 cm z wysoką ścianką, umieść stożkową rurkę o pojemności 50 ml pośrodku, upewniając się, że średnica stożka jest wystarczająco duża, aby pomieścić tubus używanej soczewki obiektywu.
   3. Zrobić 3% agarozy w wodzie i wlać ją do przestrzeni między szklanym naczyniem a stożkową rurką, pozostawić do ostygnięcia na 1 godzinę (Rysunek 1D). Utworzy to pierścień z litej agarozy (Rysunek 1E).
   4. Bezpiecznie przyklej tkankę do dna komory za pomocą super kleju i napełnij komorę roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła. Nałóż klej, aby przykleić tkankę do obszaru, który nie będzie obrazowany, aby umożliwić odzyskanie tkanki z naczynia bez uszkadzania obszarów zainteresowania.
      UWAGA: Ten preparat jest wrażliwy na czas, ponieważ ośrodki o współczynniku załamania światła mogą zacząć polimeryzować, chyba że zostaną zachowane z powietrza i przechowywane w temperaturze 4 °C.

2. Obrazowanie oczyszczonych próbek tkanek

1. Uzyskaj obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego dopasowanego do obiektywu 25x/0,95 NA z odległością roboczą 4 mm.
2. Włącz wszystkie odpowiednie urządzenia do przetwarzania obrazu. Umieść próbkę na stoliku i umieść kroplę roztworu pasującego do współczynnika załamania światła na górze komory montażowej.
3. Ostrożnie podejdź do mediów zanurzeniowych z obiektywem i uformuj ciągłą kolumnę mediów.
4. Korzystając z epifluorescencji, znajdź odpowiednie pole obrazowania.
5. Rozpocznij procedurę akwizycji obrazu od przetestowania odpowiednich ustawień.
   1. Zacznij od ustawienia rozdzielczości i prędkości skanowania, korzystając z Rysunek 2A jako przewodnik. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego należy całkowicie zamknąć otwór, aby uzyskać najmniejszy przekrój optyczny, a tym samym najlepszą rozdzielczość z.
   2. Stopniowo zwiększaj moc lasera/wzmocnienie czujnika, aż do uzyskania odpowiedniego obrazu o wysokim stosunku sygnału do szumu.
   3. Jeśli korzystasz ze standardowego dwukolorowego obrazowania EGFP/tdTomato, ustaw ustawienia zbierania światła, używając Rysunek 2B jako wskazówkę.
   4. Ustaw parametry z-stack na podstawie obserwowanych punktów początkowych i końcowych tkanki. Ustaw rozmiar kroku w oparciu o żądaną rozdzielczość z, korzystając z Rysunek 2C jako przewodnika.
      UWAGA: Mniejsze rozmiary kroków zapewnią większą rozdzielczość z, ale wprowadzą również dłuższy czas przebywania lasera, co potencjalnie prowadzi do wybielania próbki.
   5. Jeśli ustawienia akwizycji obrazu są zadowalające, uzyskaj obraz.
   6. Upewnij się, że obraz ma wysoki stosunek sygnału do szumu i pokazuje wyraźne granice struktur (Rysunek 2D).

3. Przetwarzanie obrazu i kwantyfikacja 3D za pomocą oprogramowania do analizy mikroskopowej

UWAGA: Pakiety oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych to potężne narzędzia do trójwymiarowej wizualizacji i przetwarzania obrazów. Wiele z tych programów doskonale nadaje się do obsługi dużych zbiorów danych, które są generowane na podstawie obrazowania oczyszczonych próbek tkanek. Poniższe kroki i związane z nimi rysunki odpowiadają przepływowi pracy w oprogramowaniu Imaris.

1. Otwórz stos obrazów i zaimportuj go do wybranego oprogramowania analitycznego.
2. Wyświetl obraz w przestrzeni trójwymiarowej i wprowadź dowolne zmiany w tabelach przeglądowych za pomocą regulatora wyświetlania, aby lepiej zobrazować obraz.
   UWAGA: Rysunek 3A pokazuje możliwą ekstremalną głębokość obrazowania dostępną za pomocą mikroskopii 2-fotonowej w połączeniu z oczyszczaniem tkanek CLARITY. Rysunek 3B pokazuje wyraźne wyrostki dendrytowe, a także wyraźnie widoczne morfologie kolców z komina Z przedstawione w {{TAG_ 320}}Rysunek 3A.
3. Aby odfiltrować dowolne spójne tło, kliknij przycisk Przetwarzanie obrazu i wybierz filtr odejmowania tła.
   UWAGA: Rysunek 3C pokazuje obraz ze stałym sygnałem zamglonego tła przed przetworzeniem. Rysunek 3D pokazuje obraz po zastosowaniu filtra odejmowania tła.
4. Obserwuj obraz 3D i zapoznaj się z nim, patrząc na niego pod różnymi kątami i na wielu poziomach powiększenia.
5. Rozpocznij śledzenie dendrytów, wybierając najpierw narzędzie Filament .
6. Kliknij na Edytuj filament ręcznie, pomiń automatyczne tworzenie.
7. Ustaw tryb na auto path i sprawdź Auto-center i Auto-diameter.
8. Shift + kliknij prawym przyciskiem myszy treść komórki, aby ustawić punkt początkowy.
9. Śledź neuron na całej długości dendrytu; Kliknij lewym przyciskiem myszy na końcu dendrytu, aby ustawić punkt zakończenia, aby umożliwić oprogramowaniu automatyczne obliczenie ścieżki między punktem początkowym i końcowym.
10. Powtórz ten krok dla wszystkich dendrytów i w pełni prześledź strukturę komórki.
11. Zwizualizuj śledzoną komórkę i potwierdź jej dokładność. W razie potrzeby dokonaj ręcznych regulacji.
12. Wybierz Creation .
13. Wybierz opcję Przelicz średnicę dendrytu.
14. Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora, aby uzyskać dokładniejszy dendryt.
15. Wybierz Draw .
16. Kliknij na Grzbiet , aby rozpocząć rysowanie grzbietów.
17. Ustaw przybliżoną średnicę grzbietu zgodnie z potrzebami i użyj narzędzia pomiarowego, aby uzyskać dokładne odwzorowanie średnic kręgosłupa.
18. Kliknij na środek głów kręgosłupa, aby dodać nowy kręgosłup.
19. Powtórz to dla wszystkich kolców dendrytu.
    UWAGA: Ważne jest, aby obserwować dendryt pod wszystkimi możliwymi kątami podczas ręcznego dodawania kolców.
20. Sprawdź nowo dodane kolce pod kątem dokładności i wprowadź zmiany w razie potrzeby.
21. Wybierz Creation .
22. Wybierz opcję Przelicz średnicę kręgosłupa , aby umożliwić oprogramowaniu określenie prawidłowych średnic głowy i szyi, które mają kluczowe znaczenie dla dalszej analizy danych.
23. Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora tworzenia średnicy grzbietu, aby zakończyć.
24. Obserwuj wynik obliczeń i w razie potrzeby dokonaj ręcznych korekt. Rysunek 3E przedstawia w pełni prześledzony neuron wraz z kolcami.
25. Aby utworzyć klasyfikowaną listę kolców, wybierz Narzędzia zakładka.
    UWAGA: Aby to zadziałało, należy zainstalować rozszerzenie MATLAB.
    1. Aby zainstalować rozszerzenie MATLAB, otwórz okno preferencji.
    2. Wybierz opcję Narzędzia niestandardowe.
    3. Dodaj odpowiednie środowisko uruchomieniowe MCR programu MATLAB.
26. Kliknij na Klasyfikuj kolce.
27. Edytuj żądane parametry klasyfikacji kręgosłupa.
28. Kliknij na Classify Spines w rozszerzeniu MATLAB. Rysunek 3F pokazuje dendryt pokryty kolorowymi sklasyfikowanymi kolcami.
29. Wybierz Statystyki .
30. Skonfiguruj żądane statystyki, aby określić ilościowo dane, klikając Skonfiguruj w lewym dolnym rogu tej karty.
31. {{ TAG_670}}Po wybraniu metody reprezentacji statystyk wyeksportuj dane za pomocą przycisku Eksportuj statystyki na karcie do pliku znajdującego się w prawym dolnym rogu tego okna.
32. Wykres statystyk przy użyciu preferowanej metody tworzenia wykresów.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
15 mL rurka stożkowa	Thermo Scientific	339650
25 G x 1" Igła	BD	305127
30% Akrylamid (No-bis)	National Diagnostics	EC-810
50 mL rurka stożkowa	Thermo Scientific	339653
Elektroforetyczne rozwiązanie do oczyszczania tkanek	Logos	C13001
Histodenz	Sigma	D2158-100G
Zestaw roztworów hydrożelowych	Logos	C1310X
Imaris	Oxford Instruments	N/A
Paraformaldehyd 16%	EMS	15710
PBS, 1x, 500 mL, 6 butelek/opakowanie		MT21040CV
VA-044	Wako	925-41020
System polimeryzacji X-CLARITY	Logos	C20001
System oczyszczania tkanek X-CLARITY II	Logos	C30001

fisher