$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Analizy morfologiczne neuronów ziarnistych móżdżku lub CGN - trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja oraz powierzchnia i objętość komórkowa
- Obraz pojedynczych elektroporowanych CGN na mikroskopie konfokalnym przy 63-krotnym obiektywie z 2-krotnym zoomem, wykonując obrazy z-stack z prędkością 0,5 μm na stos. Obraz po jednej komórce na okno obrazu, aby umożliwić łatwą analizę i rekonstrukcję obrazu.
- Zainstaluj wtyczkę Simple Neurite Tracer dla FIJI, korzystając z poniższego linku (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions), aby łatwo i skutecznie śledzić strukturę elektroporowanych CGN w przestrzeni trójwymiarowej (3D).
UWAGA: Istnieje zaktualizowana wersja wtyczki (https://imagej.net/SNT).
- Analizuj długość neurytów i tworzenie się pazurów dendrytycznych w sposób zaślepiony za pomocą prostego znacznika neurytowego. Prześlij jednokanałowe obrazy z-stack elektroporowanych CGN-ów na FIDŻI i kliknij Wtyczki | Segmentacja | Prosty znacznik neurytu (Rysunek 1D).
- Przejdź do menu rozwijanego i wybierz opcję Utwórz nową przeglądarkę 3D (Figure 1D).
- Przewiń do podstawy dendrytu, gdzie łączy się z somą komórkową, i rozpocznij ścieżkę, klikając skrzyżowanie. Ręcznie prześledź ścieżkę, klikając sekcje, w których sygnał wypełniania komórek jest najjaśniejszy, naciskając [y], aby zachować ślad. Śledź do końca dendrytu, jeśli nie zawiera pazura lub do podstawy pazura i potwierdź ścieżkę, naciskając [f] (Rysunek 2D).
- Następnie obrysuj pazur, rozpoczynając ścieżkę u podstawy struktury i śledząc aż do końca najdłuższego neurytu. Śledź gałęzie drugorzędne i trzeciorzędne, przytrzymując klawisz [ctrl] w systemie Windows lub [alt] w systemie Mac OS i klikając ścieżkę. Potwierdź ścieżkę, naciskając [f].
- Zwróć uwagę, że pomiary dla śladów są widoczne w osobnym oknie; Zsumuj wszystkie wymiary gałęzi pazurów (pierwszorzędowych, drugorzędnych, trzeciorzędowych), aby uzyskać całkowitą długość każdego pazura.
- Aby przeanalizować pole powierzchni i objętość komórkową elektroporowanych CGN, pobierz oprogramowanie do analizy komórek Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
UWAGA: FIJI może być również używany do rekonstrukcji komórek w 3D z obrazów z-stack za pomocą łatwo dostępnych i darmowych wtyczek. Dodatkowo Simple Neurite Tracer ma funkcję renderowania wolumetrycznego, ale Imaris został użyty z powodów opisanych poniżej.
- Prześlij obraz z-stack elektroporowanego CGN do Imaris. Uzyskaj dostęp do zestawu narzędzi do rekonstrukcji 3D, naciskając przycisk Surpass.
- Aby zrekonstruować CGN, naciśnij przycisk Powierzchnie i wybierz obszar zainteresowania, który obejmuje całą komórkę w oknie obrazu. Po zakończeniu naciśnij niebieską strzałkę do przodu w prawym dolnym rogu w obszarze Utwórz.
- Jeśli obraz zawiera wiele kanałów dla różnych sygnałów, wybierz kanał zawierający elektroporowany CGN i naciśnij niebieską strzałkę do przodu.
- Korzystając z paska bocznego, ustaw żądany próg, który najdokładniej pasuje do sygnału elektroporowanego ogniwa. Powiększ bliżej powierzchni komórki, aby dokładnie określić próg. Po zakończeniu naciśnij podwójną zieloną strzałkę, aby zrekonstruować komórkę i uzyskać powierzchnię oraz rozmiar woluminu z metadanych.
