Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Streszczenie

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo mikrogleju i dynamiki wapnia neuronów

1. Przyzwyczajenie myszy do aparatury mikroskopowej

1. Trzy tygodnie po operacji wywołaj znieczulenie u myszy 3% izofluranem i umieść mysz pod 25-krotną soczewką obiektywową mikroskopu dwufotonowego za pomocą specjalnie wykonanego instrumentu stereotaktycznego (Rysunek 1C). W konfiguracji mysz jest ustawiona na szczycie bieżni i może swobodnie działać.
2. Około 10 minut później wyjmij mysz ze stolika mikroskopu i włóż ją z powrotem do klatki domowej. Powtarzaj habituację co najmniej 3 razy co drugi dzień przed akwizycją obrazu dwufotonowego.

2. Akwizycja obrazu dwufotonowego

UWAGA: Zalecamy wykonanie akwizycji obrazu po ponad 4 tygodniach od zabiegu, ponieważ aktywacja mikrogleju stopniowo wraca do poziomu podstawowego.

1. Wywołaj znieczulenie u myszy za pomocą 3% izofluranu i umieść mysz pod soczewką obiektywu mikroskopu dwufotonowego za pomocą specjalnie wykonanego instrumentu stereotaktycznego.
2. Zainstaluj wykonane na zamówienie urządzenie zacieniające (Rysunek 1A i Rysunek 1B) oraz monitor LCD do stymulacji wizualnej, jak opisano poniżej (Rysunek 1D).
   1. Ustaw soczewkę tak, aby ustawiła ostrość na powierzchni mózgu, a następnie ustaw tę pozycję soczewki jako oryginalną pozycję Z. Utrzymuj stałe współrzędne x-y i podnieś soczewkę obiektywu; Zdejmij mysz i instrument stereotaktyczny z soczewki obiektywu i bieżni.
   2. Przymocuj urządzenie zacieniające na górze płyty głowicy za pomocą silikonu, który jest czerniony przez zmieszanie z proszkiem węgla drzewnego, i upewnij się, że przestrzeń między płytą głowicy a urządzeniem zacieniającym jest dobrze uszczelniona.
   3. Napełnij urządzenie zacieniające wodą destylowaną, a następnie ponownie zamocuj mysz i ramkę stereotaktyczną pod obiektywem i na bieżni. Ostrożnie zresetuj płaszczyznę ogniskowej na powierzchni mózgu, sprawdzając głębokość soczewki obiektywu.
      UWAGA: Aby uniknąć ryzyka uszkodzenia soczewki obiektywu, najpierw ustaw współrzędne xyz, a następnie zastosuj urządzenie zacieniające soczewki obiektywu. Rozsądne jest również zainstalowanie najpierw pokrywy, a następnie dostosowanie współrzędnych, ale w przypadku tej opcji konieczne jest ostrożne obchodzenie się z nią.
   4. Przykryj soczewkę obiektywu czarną folią aluminiową, aby uniknąć zanieczyszczenia światłem z monitora LCD używanego do stymulacji wzrokowej przez soczewkę obiektywu (Rysunek 1D). Ustaw 10-calowy monitor LCD na wysokości 12,5 cm przed oczami myszy, aby prezentować bodźce wizualne (Rysunek 1D).
3. Skonfiguruj filtry zbierające emisję fluorescencji na fluorescencję EGFP (filtr emisyjny 525/50 nm) i fluorescencję R-CaMP (filtr emisji 593/46 nm) oraz długość fali wzbudzenia na 1 000 nm. Uzyskuj obrazy z rozdzielczością przestrzenną 0,25 μm/piksel za pomocą obiektywu 25x 1,1 NA i PMT GaAsP.
4. Znajdź region obrazowania, w którym neurony R-CaMP (+) i mikroglej EGFP (+) mogą być jednocześnie obrazowane w warstwie 2/3. W tym przypadku dane uzyskane na Rysunek 2 znajdowały się na głębokości 100 μm od powierzchni obrazu, przy użyciu podglądu obrazu na żywo. Utrzymuj moc lasera wzbudzającego na jak najniższym poziomie, aby uniknąć fotowybielania i uszkodzeń spowodowanych podwyższoną lokalną temperaturą w obszarze obrazowania.
5. Rejestruj obrazy z częstotliwością odświeżania 30 Hz. Równocześnie z akwizycją obrazu prezentuj myszce dryfujące bodźce wizualne o 100% kontraście, 1,5 Hz, 0,04 cykli na stopień w 12 kierunkach w 6 orientacjach od 0° do 150° w krokach co 30°.
6. Po uzyskaniu obrazu wyjmij mysz ze stolika mikroskopu, odłącz urządzenie zacieniające i instrument stereotaktyczny od myszy i umieść mysz z powrotem w klatce domowej.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10-calowy monitor LCD	EIZO	DuraVision FDX1003	Do prezentacji siatkowych bodźców wizualnych
Czarna folia aluminiowa	}THORLABS	BKF12
CX3CR1-EGFP mouse	Jackson laboratory	IMSR_JAX: 005582	CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out myszy eksprymujące EGFP w mikrogleju w mózgu pod kontrolą endogennego locus Cx3cr1
DENT SILICONE-V	Shofu Inc	N/A	Do dołączenia urządzenia cieniującego do head-plate
Head-plate	Customized	N/A	Materiał: SUS304, grubość: 0.5mm
Isoflurane	Pfizer	N/A
Mikroskop wzbudzenia wielofotonowego	NIKON	N/ A	Nazwa handlowa to "A1MP+"
Obiektyw	NIKON	N/A	Nazwa handlowa to "CFI75 apochromat 25xC W".
Psychtoolbox		Darmowe oprogramowanie	Do prezentacji siatkowych bodźców wzrokowych
Urządzenie zacieniające	Customized	N/A
Instrument stereotaktyczny	Customized	N/A	Do mocowania myszy pod mikroskopem dwufotonowym
Bieżnia	Customized	N/A