Kwantyfikacja nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej szczura przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego

Abstract

Źródło: Olesen, M. V., et al. Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej. J. Vis. exp. (2017).

Film demonstruje technikę ilościowego określania nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej. Wycinki tkanki hipokampa zawierające neurony znakowane bromodeoksyurydyną (BrdU) wybarwiono za pomocą immunohistochemii, a następnie określono ilościowo na całej grubości tkanki przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etyki zwierząt.

1. Przetwarzanie tkanki

UWAGA: Po transcardial perfusion and postfixation w 4% paraformaldehydzie (PFA) rozcieńczonym w 0,2 M buforze fosforanowym przez noc w temperaturze 4 °C, mózgi są przenoszone do 30% sacharozy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez trzy dni w temperaturze 4 °C. Następnie mózgi zamraża się na sproszkowanym suchym lodzie i przechowuje w temperaturze -80 °C do momentu pokrojenia.

1. Oddziel prawą i lewą półkulę wzdłuż linii środkowej mózgu za pomocą skalpela. Następnie wybierz losowo jedną lub drugą półkulę w pierwszym mózgu. Następnie systematycznie przełączaj się między prawą i lewą półkulą (Figure 1AFigure 1B).
   1. Umieść wszystkie próbkowane sekcje kolejno w chłodzonych pojemnikach wielotalerzowych, aby utrzymać sekcje w kolejności cięcia.
   2. 2. Barwienie immunologiczne

      UWAGA: Aby śledzić poszczególne sekcje podczas procedury barwienia, umieść pobrane sekcje w 25-dołkowych siatkach do barwienia. Użyj co 5 sekcji, podając średnią końcową liczbę 12 (8-16) sekcji na hipokamp do barwienia immunologicznego i późniejszego liczenia komórek.

      1. Przed podpróbkowaniem każdej n-tej sekcji z losowym początkiem między sekcjami od pierwszej do n (Rysunek 1C), przenieś pojemniki z temperatury -20 °C do temperatury pokojowej (RT).
      2. UWAGA: ₂O₂) rozcieńczony w wodzie destylowanej (dH₂O) przez 20 min.
      4. ₂O₂ przez 10 min w RT.
      5. ₂₂O przez 15 min.
      6. 3. Oszacowanie całkowitej liczby neuronów znakowanych BrdU za pomocą frakcjonatora optycznego

         UWAGA: Przeprowadź badanie pilotażowe, które obejmuje kilka zwierząt, aby określić optymalne parametry próbkowania, takie jak liczba sekcji do analizy i liczba dyssektorów optycznych w próbkowanych sekcjach. Ten program pilotażowy zapewnia również wstępne CV (odchylenie standardowe/średnia) oraz możliwość dostosowania CE w celu uzyskania zadowalającej precyzji oszacowań określonych przez badacza (więcej szczegółów poniżej). Podobnie, analiza rozkładu z będzie dotyczyła następujących punktów: kurczenie się tkanek, jakość barwienia w całym przekroju oraz rozmieszczenie komórek w osi z.

         1. Sprawdź grubość tkanki w sekcjach, aby potwierdzić, że są one odpowiednie do użycia frakcjonatora optycznego, np. wystarczająco grube dla wysokości wybranego sektora, w tym strefy ochronne (patrz poniżej). NOTE: Grubość tkanki jest mierzona w kilku miejscach w obszarze zainteresowania.
            1. Umieść szkiełka na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu i włącz preferowane oprogramowanie stereologiczne.
            2. Figure 2Ae.g.,Figure 2B).
            3. Figure 2B).
         2. UWAGA:
         3. Próbkuj neurony oznaczone BrdU i zarejestruj ich pozycję z wraz z lokalną grubością przekroju mierzoną w wybranym rogu każdej ramki liczenia.
         4. UWAGA:
         5. Określ obszar zainteresowania na wszystkich sekcjach, które mają być analizowane, i zarejestruj obszary.
         6. UWAGA:_step).
         7. _step, co zapewni rozmiar kroku x-y.
      8. Ustaw rozmiar ramki zliczającej na dowolną jednostkę i wykonaj pilotażowe próbkowanie neuronów BrdU-dodatnich, korzystając z parametrów uzyskanych w sekcjach 3.3 i 3.4.
         UWAGA:UWAGA: Figure 2B). Nie licz neuronów BrdU-dodatnich, które dotykają linii wykluczenia, gdy są wyraźnie rozpoznawane przez cechę zainteresowania wewnątrz wysokości rozsektora. Niezwykle ważne jest uważne przestrzeganie tych zasad liczenia podczas całej kwantyfikacji stereologicznej.
         UWAGA:

Results

Materials