Kwantyfikacja nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej szczura przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego

Streszczenie

Źródło: Olesen, M. V., et al. Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej. J. Vis. exp. (2017).

Film demonstruje technikę ilościowego określania nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej. Wycinki tkanki hipokampa zawierające neurony znakowane bromodeoksyurydyną (BrdU) wybarwiono za pomocą immunohistochemii, a następnie określono ilościowo na całej grubości tkanki przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etyki zwierząt.

1. Przetwarzanie tkanki

UWAGA: Po transcardial perfusion and postfixation w 4% paraformaldehydzie (PFA) rozcieńczonym w 0,2 M buforze fosforanowym przez noc w temperaturze 4 °C, mózgi są przenoszone do 30% sacharozy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez trzy dni w temperaturze 4 °C. Następnie mózgi zamraża się na sproszkowanym suchym lodzie i przechowuje w temperaturze -80 °C do momentu pokrojenia.

1. Oddziel prawą i lewą półkulę wzdłuż linii środkowej mózgu za pomocą skalpela. Następnie wybierz losowo jedną lub drugą półkulę w pierwszym mózgu. Następnie systematycznie przełączaj się między prawą i lewą półkulą (Figure 1AFigure 1B).
   1. Umieść wszystkie próbkowane sekcje kolejno w chłodzonych pojemnikach wielotalerzowych, aby utrzymać sekcje w kolejności cięcia.
   2. 2. Barwienie immunologiczne

      UWAGA: Aby śledzić poszczególne sekcje podczas procedury barwienia, umieść pobrane sekcje w 25-dołkowych siatkach do barwienia. Użyj co 5 sekcji, podając średnią końcową liczbę 12 (8-16) sekcji na hipokamp do barwienia immunologicznego i późniejszego liczenia komórek.

      1. Przed podpróbkowaniem każdej n-tej sekcji z losowym początkiem między sekcjami od pierwszej do n (Rysunek 1C), przenieś pojemniki z temperatury -20 °C do temperatury pokojowej (RT).
      2. UWAGA: ₂O₂) rozcieńczony w wodzie destylowanej (dH₂O) przez 20 min.
      4. ₂O₂ przez 10 min w RT.
      5. ₂₂O przez 15 min.
      6. 3. Oszacowanie całkowitej liczby neuronów znakowanych BrdU za pomocą frakcjonatora optycznego

         UWAGA: Przeprowadź badanie pilotażowe, które obejmuje kilka zwierząt, aby określić optymalne parametry próbkowania, takie jak liczba sekcji do analizy i liczba dyssektorów optycznych w próbkowanych sekcjach. Ten program pilotażowy zapewnia również wstępne CV (odchylenie standardowe/średnia) oraz możliwość dostosowania CE w celu uzyskania zadowalającej precyzji oszacowań określonych przez badacza (więcej szczegółów poniżej). Podobnie, analiza rozkładu z będzie dotyczyła następujących punktów: kurczenie się tkanek, jakość barwienia w całym przekroju oraz rozmieszczenie komórek w osi z.

         1. Sprawdź grubość tkanki w sekcjach, aby potwierdzić, że są one odpowiednie do użycia frakcjonatora optycznego, np. wystarczająco grube dla wysokości wybranego sektora, w tym strefy ochronne (patrz poniżej). NOTE: Grubość tkanki jest mierzona w kilku miejscach w obszarze zainteresowania.
            1. Umieść szkiełka na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu i włącz preferowane oprogramowanie stereologiczne.
            2. Figure 2Ae.g.,Figure 2B).
            3. Figure 2B).
         2. UWAGA:
         3. Próbkuj neurony oznaczone BrdU i zarejestruj ich pozycję z wraz z lokalną grubością przekroju mierzoną w wybranym rogu każdej ramki liczenia.
         4. UWAGA:
         5. Określ obszar zainteresowania na wszystkich sekcjach, które mają być analizowane, i zarejestruj obszary.
         6. UWAGA:_step).
         7. _step, co zapewni rozmiar kroku x-y.
      8. Ustaw rozmiar ramki zliczającej na dowolną jednostkę i wykonaj pilotażowe próbkowanie neuronów BrdU-dodatnich, korzystając z parametrów uzyskanych w sekcjach 3.3 i 3.4.
         UWAGA:UWAGA: Figure 2B). Nie licz neuronów BrdU-dodatnich, które dotykają linii wykluczenia, gdy są wyraźnie rozpoznawane przez cechę zainteresowania wewnątrz wysokości rozsektora. Niezwykle ważne jest uważne przestrzeganie tych zasad liczenia podczas całej kwantyfikacji stereologicznej.
         UWAGA:

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU	Sigma-Aldrich	19-160
Cresyl Violet	Sigma-Aldrich	C5042	Zawiera następujące elementy materiały na 1 l: 0,2 g fioletu krezylowego; 2,0 g octan sodu, 3 H2O; 3 ml kwasu lodowatego octowego; 1000 ml destylowany woda
Cryoprotectant	Capital Region Pharmacy, DK	861334	Zawiera następujące materiały: sacharoza; poliwinylopirolidon PVP 40; bufor fosforanu sodu (0,2 M); glikol etylenowy; demineralizowany woda.
dH2O	Capital Region Pharmacy, DK	817205
Diaminobenzydyna – DAB	Sigma-Aldrich	D5637
Envision-HRP	DAKO	K4001	Polimer znakowany peroksydazą sprzężony z kozioł anti-mouse immunoglobuliny
Etanol - 70 %	Plum A/S	201098
Ethanol - 96 %	Plum A/S	201104
Ethanol - 99.9 %	Plum A/S	201111
Fetal bydlęca surowica	In Vitro	BI-04-003-1A
H2O2 30%	Capital Region Pharmacy, DK	896456
HCl	J. T. Baker	6081
Mounting medium	Sakura	4583	Tissue Tek
Mouse-anti-BrdU	Becton-Dickinson	347580
PBS buffer	Capital Region Pharmacy, DK	853436	pH = 7.4
PFA	VWR	28,794,295	pH = 7.4
Phosphate buffer	866533	0.1 mol/l, pH 7.4
Szybkoschnący nośnik montażowy	Histolab Products AB	801	Pertex
Sodium Tetraborate	Merck A/S	1,063,080,500
sacharoza	Merck A/S	1,076,515,000
Triton X-100	Merck A/S	1,086,031,000
Xylene	VWR	28,973,363
Cover slips	Menzel-Gläser
Cryostat	Leica	CM1860
Digital Microcator	Heidenhain	VRZ 401
Glass dish	Brain Resaerch Laboratories	1256
Mikroskop	Nikon	Eclipse 80i
Kamera mikroskopowa	DP72
Preparaty mikroskopowe	VWR	48311-703	SuperFrost+
Motorized stage	Prior
Multidish Containers	Sigma-Aldrich	D6315-1CS	Nuclon 12-wells
New-Cast software	Visiopharm	ver. 4.5.6.440
Objective 2x	Nikon	CFI Plan UW 2X
Objective 4x	Nikon	CFI Plan Fluor 4X
Objective 10x	Nikon	CFI Plan Fluor 10X
Obiektywne 100-krotne zanurzenie w oleju	Nikon	CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil	Apertura numeryczna 1.40
Orbital shaker	Gemini BV	CM-9	Sarstedt
Stojak na slajdy	Sakura	4465
Naczynia do barwienia slajdów	4457	Tissue-Tek
Specimen disc	Leica	14037008637
Staining nets	Laboratoria Badań nad Mózgiem	2512	25-wells