Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Streszczenie

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015)

{{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Protokół

1. Obrazowanie fluorescencyjne

1. Obraz Drosophila } za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Co 7 minut wychwytuj seryjne odcinki przez domenę wierzchołkową nabłonka nerwowego oka, w okolicy połączeń przylegających.
   UWAGA: a) Odpowiednie sekcje szeregowe to zwykle 4-5 na stos z, składający się z kroków co 0,2 μm. b) Nieprawidłowości w topologii nabłonka, w tym łagodne nierówności i fałdy, mogą utrudniać uzyskanie ostrych obrazów dużych obszarów tkanki. Podczas obrazowania może się okazać, że część obszaru zainteresowania jest wyostrzona, a sąsiedni region jest nieostry. Włączenie małej kropli wody destylowanej między oko poczwarki a szkiełko nakrywkowe może wyeliminować niektóre ostre fałdy tkankowe, ale nie łagodnie nierówną topologię charakterystyczną dla wczesnych stadiów morfogenezy oka poczwarki. W takich przypadkach należy nadpróbkować tkankę, wydłużając stos z, aż zostaną uzyskane ostre wycinki dla całego pola. c) Przechwytywanie odcinków seryjnych co 7 minut powinno umożliwić obrazowanie na żywo przez 3 do 4 godzin bez znacznego zmniejszenia intensywności fluorescencji białka zielonej fluorescencji (GFP), która może pogorszyć jakość obrazu. Krótsze odstępy czasu mogą skrócić całkowity czas obrazowania.
2. Kontynuuj obrazowanie przez 3 do 4 godzin. Nie należy korzystać z funkcji automatycznego ustawiania ostrości i czasu, która jest dostępna w wielu mikroskopach fluorescencyjnych, ponieważ wzrost poczwarki i pompowanie hemolimfy przesuwa pozycję siatkówki i wymagane jest czujne ponowne ustawianie ostrości co 14-21 minut.

UWAGA: Obrazowanie trwające dłużej niż 4 godziny może spowolnić lub zatrzymać morfogenezę oka.

3. Użyj odpowiedniego oprogramowania do dekonwolucji, aby zmniejszyć tło i zwiększyć kontrast obrazów sekcji szeregowej. Dla każdego pliku z-stack wykonaj następujące czynności w oprogramowaniu Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF): Przejdź do panelu Narzędzia, wybierz Dekonwolucja 3D i kliknij Zastosuj.
4. Wygeneruj maksymalny obraz projekcji (MP) dla każdego pliku stosu bez konwolucji: Przejdź do panelu Narzędzia, wybierz opcję Projekcja 3D i kliknij przycisk Zastosuj.
   UWAGA: Algorytm MP może nie wygenerować jednolicie ostrego obrazu dla tkanki, która została poddana nadpróbkowaniu.

2. Przetwarzanie obrazu

1. Automatyczne wyrównanie obrazu:

UWAGA: Żywa tkanka Drosophila będzie się przesuwać i rosnąć podczas procesu obrazowania. W związku z tym środki obrazów zebranych w kolejnych punktach czasowych mogą nie odpowiadać temu samemu punktowi w tkance Drosophila. Ponadto cała tarcza siatkówki obraca się o około 30° między ~21 a 23 godziną po utworzeniu poczwarki (APF). Aby podkreślić zachowania poszczególnych komórek i zmniejszyć rozproszenie uwagi spowodowane wzrostem organizmów, wyrównaj każdy obraz MP. Chociaż można to zrobić ręcznie, używane tutaj oprogramowanie do edycji obrazu ma wbudowane algorytmy, które mogą przyspieszyć ten proces.

2. Na karcie Plik w menu głównym otwórz Skrypty i wybierz Załaduj pliki do stosu.
3. Zaimportuj pliki obrazów MP do panelu Wczytaj warstwy i wybierz przycisk OK. Upewnij się, że opcja Próba wyrównania obrazów źródłowych nie jest zaznaczona automatycznie.
4. UWAGA: Jeśli ta opcja jest wybrana, oprogramowanie może użyć algorytmu wyrównania, który zniekształca dane obrazu.
5. Po załadowaniu wszystkich plików MP do panelu Warstwy upewnij się, że wszystkie obrazy są w porządku chronologicznym, tak aby najwcześniejszy punkt czasowy znajdował się na górze stosu warstw. Jeśli warstwy nie są w prawidłowej kolejności, przeciągnij je i upuść, aż zostaną poprawnie uporządkowane.
6. Wybierz opcję Automatycznie wyrównaj warstwy na karcie Edycja w menu głównym. Wybierz opcję Zmień położenie i kliknij przycisk OK.
7. Jeśli algorytm automatycznego wyrównywania nie zdoła ustawić ramek w odpowiednim punkcie centralnym, wprowadź drobne korekty za pomocą narzędzia Przesuń.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b
Szkiełko mikroskopowe 25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-413
Szkiełko nakrywkowe 22 x 40 mm	VWR	48393-172
Kleszcze	Fine Science Tools	91150-20
Bibuła chromatograficzna Whatman 3 mm	Fisher Scientific	05-713-336
Wazelina	Fisher Scientific	19-086-291
30 ml strzykawka	Fisher Scientific	S7510-30
Adobe Photoshop CS5	Mikroskop Adobe
Leica TCS SP5 DM	Leica Microsystems
LAS AF Wersja 2.6.0.7266 oprogramowanie mikroskopu	Leica Microsystems