Podłużne obrazowanie dwufotonowe znakowanych fluorescencyjnie neuronów w żywym hipokampie myszy

Streszczenie

Źródło: Ulivi, A. F., et. al. Podłużne dwufotonowe obrazowanie grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy. J. Vis. exp. (2019)

Ten film pokazuje podłużne obrazowanie dwufotonowe znakowanych fluorescencyjnie neuronów piramidowych u żywej myszy, prezentacja preparatu, wyrównania kaniuli oraz obrazowania dendrytów i kolców dendrytycznych w celu zbadania struktury neuronalnej w regionie CA1 hipokampa.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie sesji obrazowania
2. Włącz wcześniej konfigurację obrazowania i pozwól laserowi rozgrzać się i ustabilizować, jeśli to konieczne.
3. Znieczulij mysz. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia z 3% izofluranem w 1 l/min O₂ i poczekaj, aż straci przytomność. Oceń znieczulenie za pomocą testu odruchu szczypania palców u stóp.
4. Za pomocą kleszczyków ostrożnie usuń folię samoprzylepną z płyty uchwytu głowicy. Trzymaj mysz w dłoni, a palcami płytkę uchwytu głowy. Delikatnie usuń folię, aby uniknąć uszkodzenia preparatu.
5. Umieść mysz pod mikroskopem, nad dywanem grzewczym i przymocuj płytę głowicy do uchwytu (Rysunek 1D).
6. Ustaw stożek nosowy tak, aby zakrył pysk i zmniejsz izofluran do 1,5-2%.
7. Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy.
8. Wyczyść kaniulę obrazowania, spłukując ją wodą dejonizowaną. Użyj strzykawki i cienkiej igły, aby wkroplić wodę do kaniuli i pompy próżniowej, aby ją usunąć.

2. Sesja obrazowania

1. Użyj obiektywów o małym powiększeniu i dużej odległości roboczej, aby wizualnie sprawdzić kaniulę pod kątem resztek wody, brudu, integralności i obecności fluorescencji.
2. Dopasuj kaniulę do osi optycznej, regulując kąty ramion uchwytu głowy.
3. Przełącz się na obiektywy 25X 1.0 NA (przysłona numeryczna), 4 mm WD (odległość robocza) lub 40X 0.8 NA, 3 mm WD, zanurzenie w wodzie. Dodaj tyle wody dejonizowanej, aby napełnić kaniulę i utrzymać nadmiar wody na wierzchu kaniuli. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
4. Użyj wzbudzenia dwufotonowego (2P) i sygnałów fluorescencyjnych obrazu.
   UWAGA: Protokół obrazowania jest w dużym stopniu zależny od czasu i skali przestrzennych, które mają być zobrazowane. Zapoznaj się z reprezentatywnymi wynikami i dyskusją tej sekcji, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat ustawień obrazowania, których użyliśmy do stworzenia obrazów pokazanych w tym artykule.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rura ze stali nierdzewnej Ø 3,0 x 0,25 mm (wewnętrzna Ø 2,5 mm ) L = 500 mm	Sawade	R00303	Rurka ze stali nierdzewnej do metalowego pierścienia kaniuli
Szkło nakrywkowe mikroskopu (okrągłe 4 mm)	Engelbrecht Medizin and Labortechnik		Szklane szkiełka nakrywkowe do kaniuli glass
Isofluran CP, Flasche 250 ml	Henry Schein VET GmbH	798932	Płynny izofluran do znieczulenia
Aparat Harvard Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer	Harvard Apparatus GmbH	34-1040	Waporyzator izofluranu
Aktywny wymiatacz laboratoryjny	Gropper Medizintechnik	UV17014	Isoflurane scavenger system
Regulator temperatury CMA 450	Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH	8003770	Koc grzewczy<
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer AG		Maść oftalmiczna
Płyty główne	Niestandardowy made		30 mm x 10 mm rozmiar; otwór o średnicy 8 mm, tytan<
Zacisk płyty głównej	Custom made		Uchwyt na płytę główną
Uchwyty na postumenty	Thorlabs	PH20E/M	Uchwyt na głowę
Słupek ze stali nierdzewnej	Thorlabs	TR30/M	Uchwyt na głowę
Słupek ze stali nierdzewnej	Thorlabs	TR75/M	Uchwyt na głowę
Słupek ze stali nierdzewnej	Thorlabs	TR150/M	Uchwyt na głowę
Zaciski łącznika słupków	Custom made		Uchwyt płyty głowicy
Aluminiowa tablica stykowa, 300 mm x 450 mm x 12,7 mm, Krany M6	Thorlabs	MB3045/M	Stolik mikroskopowy
7" x 4" Lab Jack	Thorlabs	L490/M	Stolik mikroskopowy
Maska na twarz o niskim profilu	Emka Technologies	VetFlo-0801	Uchwyt na maskę anestezjologiczną
Model miernika mocy 1918-R	Newport		Miernik mocy
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies		Lampa fluorescencyjna
mikroskop dwufotonowy	Bruker	Ultima IV	mikroskopy dwufotonowe
mikroskop dwufotonowy	Thorlabs	Bergamo	mikroskopy dwufotonowe
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22	Olympus		Cele
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	Olympus		Cele
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	Olympus		Objectives
Przestrajalny laser Ultafast do wzbudzenia 2P	Spectraphysics	Mai Tai Deep See	Lasery ekscytacyjne
Ultafast przestrajalny laser do wzbudzenia 2P	Spectraphysics	InSight DS+ Dual beam	Excitaiton lasers
Ultafast przestrajalny laser do wzbudzenia 3P	Spójny	Monako	Ekscytacja Lasery

tr style='wysokość:21px;'>tr style='wysokość:21px;' >