Artykuł metodologiczny

Podłużne obrazowanie dwufotonowe znakowanych fluorescencyjnie neuronów w żywym hipokampie myszy

29 maja 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Ulivi, A. F., et. al. Podłużne dwufotonowe obrazowanie grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy. J. Vis. exp. (2019)

Ten film pokazuje podłużne obrazowanie dwufotonowe znakowanych fluorescencyjnie neuronów piramidowych u żywej myszy, prezentacja preparatu, wyrównania kaniuli oraz obrazowania dendrytów i kolców dendrytycznych w celu zbadania struktury neuronalnej w regionie CA1 hipokampa.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

  1. Przygotowanie sesji obrazowania
  2. Włącz wcześniej konfigurację obrazowania i pozwól laserowi rozgrzać się i ustabilizować, jeśli to konieczne.
  3. Znieczulij mysz. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia z 3% izofluranem w 1 l/min O2 i poczekaj, aż straci przytomność. Oceń znieczulenie za pomocą testu odruchu szczypania palców u stóp.
  4. Za pomocą kleszczyków ostrożnie usuń folię samoprzylepną z płyty uchwytu głowicy. Trzymaj mysz w dłoni, a palcami płytkę uchwytu głowy. Delikatnie usuń folię, aby uniknąć uszkodzenia preparatu.
  5. Umieść mysz pod mikroskopem, nad dywanem grzewczym i przymocuj płytę głowicy do uchwytu (Rysunek 1D).
  6. Ustaw stożek nosowy tak, aby zakrył pysk i zmniejsz izofluran do 1,5-2%.
  7. Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy.
  8. Wyczyść kaniulę obrazowania, spłukując ją wodą dejonizowaną. Użyj strzykawki i cienkiej igły, aby wkroplić wodę do kaniuli i pompy próżniowej, aby ją usunąć.

2. Sesja obrazowania

  1. Użyj obiektywów o małym powiększeniu i dużej odległości roboczej, aby wizualnie sprawdzić kaniulę pod kątem resztek wody, brudu, integralności i obecności fluorescencji.
  2. Dopasuj kaniulę do osi optycznej, regulując kąty ramion uchwytu głowy.
  3. Przełącz się na obiektywy 25X 1.0 NA (przysłona numeryczna), 4 mm WD (odległość robocza) lub 40X 0.8 NA, 3 mm WD, zanurzenie w wodzie. Dodaj tyle wody dejonizowanej, aby napełnić kaniulę i utrzymać nadmiar wody na wierzchu kaniuli. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.
  4. Użyj wzbudzenia dwufotonowego (2P) i sygnałów fluorescencyjnych obrazu.
    UWAGA: Protokół obrazowania jest w dużym stopniu zależny od czasu i skali przestrzennych, które mają być zobrazowane. Zapoznaj się z reprezentatywnymi wynikami i dyskusją tej sekcji, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat ustawień obrazowania, których użyliśmy do stworzenia obrazów pokazanych w tym artykule.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rura ze stali nierdzewnej Ø 3,0 x 0,25 mm (wewnętrzna Ø 2,5 mm ) L = 500 mmSawadeR00303Rurka ze stali nierdzewnej do metalowego pierścienia kaniuli
Szkło nakrywkowe mikroskopu (okrągłe 4 mm)Engelbrecht Medizin and Labortechnik Szklane szkiełka nakrywkowe do kaniuli glass
Isofluran CP, Flasche 250 mlHenry Schein VET GmbH798932Płynny izofluran do znieczulenia
Aparat Harvard Isoflurane Funnel-Fill VaporizerHarvard Apparatus GmbH34-1040Waporyzator izofluranu
Aktywny wymiatacz laboratoryjnyGropper MedizintechnikUV17014Isoflurane scavenger system
Regulator temperatury CMA 450Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH8003770Koc grzewczy<
Bepanthen Augen- und NasensalbeBayer AG Maść oftalmiczna
Płyty główneNiestandardowy made 30 mm x 10 mm rozmiar; otwór o średnicy 8 mm, tytan<
Zacisk płyty głównejCustom made Uchwyt na płytę główną
Uchwyty na postumentyThorlabsPH20E/MUchwyt na głowę
Słupek ze stali nierdzewnejThorlabsTR30/MUchwyt na głowę
Słupek ze stali nierdzewnejThorlabsTR75/MUchwyt na głowę
Słupek ze stali nierdzewnejThorlabsTR150/MUchwyt na głowę
Zaciski łącznika słupkówCustom made Uchwyt płyty głowicy
Aluminiowa tablica stykowa, 300 mm x 450 mm x 12,7 mm, Krany M6ThorlabsMB3045/MStolik mikroskopowy
7" x 4" Lab JackThorlabsL490/MStolik mikroskopowy
Maska na twarz o niskim profiluEmka TechnologiesVetFlo-0801Uchwyt na maskę anestezjologiczną
Model miernika mocy 1918-RNewport Miernik mocy
X-Cite 120QExcelitas Technologies Lampa fluorescencyjna
mikroskop dwufotonowyBrukerUltima IVmikroskopy dwufotonowe
mikroskop dwufotonowyThorlabsBergamomikroskopy dwufotonowe
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22Olympus Cele
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22Olympus Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5Olympus Cele
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18Olympus Objectives
Przestrajalny laser Ultafast do wzbudzenia 2PSpectraphysicsMai Tai Deep SeeLasery ekscytacyjne
Ultafast przestrajalny laser do wzbudzenia 2PSpectraphysicsInSight DS+ Dual beamExcitaiton lasers
Ultafast przestrajalny laser do wzbudzenia 3PSpójnyMonakoEkscytacja Lasery
tr style='wysokość:21px;'>tr style='wysokość:21px;' >

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurony fluorescencyjnepole CA1 hipokampawyr wnanie kaniulikolce dendrytyczneobrazowanie pod u neobiektyw imersyjny wodnywoda dejonizowanap ytka g owowa

Powiązane artykuły