Badanie pochodzenia neuronów czuciowych w oponie twardej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Streszczenie

Źródło: Wang, J., et al. Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje metodę śledzenia pochodzenia neuronów czuciowych w oponie twardej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Znacznik wsteczny jest wprowadzany do odsłoniętej opony twardej znieczulonego szczura. Znacznik jest pobierany przez czuciowe aksony neuronów i przemieszcza się wstecznie do ich ciał komórkowych w zwoju trójdzielnym i zwojach korzenia grzbietowego szyjki macicy. Zwoje są następnie cięte, barwione przeciwciałami, które znakują znacznik i neuropeptydy w ciałach komórkowych i analizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu potwierdzenia zwojowego pochodzenia neuronów czuciowych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Badanie śledzenia wstecznego z fluorogoldem (FG)

1. Zabiegi chirurgiczne{{}}
   1. Określ obszar współrzędnych zainteresowania w oponie twardej czaszki szczura.
   2. Przygotuj mikrostrzykawkę o pojemności 10 μl i przetestuj ją z płynną parafiną.
   3. Znieczulić szczury roztworem tribromoetanolu (150 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
   4. Ogol głowę szczura elektryczną maszynką do golenia.
   5. Załóż tępe nauszniki na szczura i umieść je na urządzeniu stereotaktycznym. Następnie załóż uchwyt na usta i nałóż maść okulistyczną na oczy.
   6. Oczyść miejsce operacji skóry głowy za pomocą 10% jodu powidonu, a następnie 75% etanolu.
   7. Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy.
   8. Tępo usuń okostną i tkanki mięśniowe z czaszki za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką (Rysunek 1A).
   9. Wywierć mały otwór (~5-7 mm) za pomocą wiertła do zadziorów z okrągłą końcówką (#106) na lewej kości ciemieniowej i skroniowej powyżej środkowej tętnicy oponowej (MMA) i upewnij się, że opona twarda czaszki jest nienaruszona (Rysunek 1B).
   10. Zbuduj bank wokół otworu z dentystycznym cementem krzemianowym, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się znacznika (Rysunek 1C).
   11. Dodaj 2 μl 2% FG do otworu wokół MMA za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl (Rysunek 1D).
   12. Przykryj otwór małym kawałkiem gąbki hemostatycznej.
   13. Połóż kawałek folii parafinowej na otworze i uszczelnij krawędzie woskiem kostnym, aby zapobiec wyciekowi znacznika i uniknąć zanieczyszczenia otaczających tkanek.
   14. Zszyj ranę sterylną nicią.
   15. Trzymaj szczury w ciepłym miejscu, dopóki w pełni nie wyzdrowieją.
   16. Wróć szczury z powrotem do ich klatek i dodaj antybiotyk i środek przeciwbólowy do wody pitnej.
2. Perfuzje i sekcje
   1. Po 7 dniach przetrwania przeprowadź perfuzję tych szczurów.
   2. Wypreparuj zwój nerwu trójdzielnego (TG) i zwoje korzenia grzbietowego C1-4 (DRG), a następnie post-fix i krioprotekcję (Rysunek 1F).
   3. Wyciąć TG i DRG o grubości 30 μm na mikrotomie kriostatu w kierunku strzałkowym i zamontować na szkiełkach pokrytych silanem.
3. Podwójne immunofluorescencje do znakowania peptydów związanych z genem FG i kalcytoniny (CGRP) w TG i DRG
   UWAGA: Chociaż znakowanie FG można bezpośrednio zaobserwować przy świetle ultrafioletowym (UV) pod lampą rtęciową bez dodatkowego barwienia, znakowane neurony z FG były dalej badane w TG i szyjkach macicy DRG przy użyciu podwójnych immunofluorescencji z FG i CGRP w celu ujawnienia pochodzenie opornych CGRP-immunoreaktywnych włókien nerwowych w TG i DRG.
   1. Zakreśl sekcje pisakiem histochemicznym.
   2. Inkubować skrawki przez 30 minut w roztworze blokującym zawierającym 3% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 w 0,1 M buforze fosforanowym (PB).
   3. Przenieść próbki do roztworu króliczego przeciwciała antyfluorogoldowego (1:1000) i mysiego przeciwciała anty-CGRP (1:1000) w 0,1 M PB zawierającym 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 °C.
   4. Następnego dnia przemyć skrawki trzykrotnie w 0,1 M PB.
   5. Inkubować w mieszanym roztworze przeciwciała anty-królika Alexa Fluor 594 (1:500) (1:500) i przeciwciała anty-myszego osła Alexa Fluor 488 (1:500) w 0,1 M PB zawierającym 1% normalnej surowicy osła i 0,5% Triton X-100 przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.
   6. Umyj i nałóż szkiełka nakrywkowe na sekcje.
4. Obserwacja i rejestracja
   1. Zrób zdjęcia neuronów znakowanych FG w TG i DRG w świetle UV za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę cyfrową.
   2. Uchwyć obrazy neuronów znakowanych FG i CGRP w TG i DRG pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę cyfrową.
   3. Użyj oprogramowania do edycji, aby dostosować jasność i kontrast obrazów oraz dodać etykiety na zdjęciach.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Chronić przed światłem; RRID: AB_141607
Mózg stereotaksis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Software of fluorescencyscent mikroskop<
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from light
Fluorescencyjny system obrazowania	Olympus	BX53
Zamrażanie microtome	Thermo	Microm InternationalGmbH
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal ośla surowica	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Protect from light
Photoshop i ilustracja	Adobe	CS6	Oprogramowanie do edycji zdjęć
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus mikroskop slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm

tr style='height:20px;'>