Monitorowanie odzyskiwania komórek międzynerwowych ablowanych laserowo u danio pręgowanego za pomocą mikroskopii konfokalnej

Streszczenie

Źródło: Volpe, B. A., et al. Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego. J. vis. exp.{{TAG_ 31}} (2020)

Ten film pokazuje monitorowanie odzyskiwania komórek międzynerwowych u danio pręgowanego za pomocą mikroskopii konfokalnej, śledzenie śmierci i naprawy komórek za pomocą poklatkowego obrazowania fluorescencyjnego.

Protokół

1. Obrazowanie po ablacji i mikroskopia poklatkowa w celu zbadania regeneracji

1. Kliknij menu rozwijane dla "Channels". W kanałach odznacz ścieżkę "DAPI"(4′,6-diamidino-2-fenyloindol), aby dezaktywować laser ablacyjny. Kliknij menu rozwijane "Tryb akwizycji".
2. W trybie akwizycji kliknij "Zoom".
3. Zmniejsz powiększenie do 0,7 za pomocą suwaka lub wpisując "0.7."
   1. Aby zapewnić udaną ablację komórek, zwiększ wzmocnienie do 900 i szybko skanuj pole widzenia.
      UWAGA: W docelowej komórce lub komórkach nie powinno być widoczne GFP (zielone białko fluorescencyjne). Korzystając z tych samych lub podobnych ustawień, jak te opisane dla obrazowania przed ablacją, uchwyć i zapisz obraz po ablacji (Rysunek 1C). Jeśli obraz ujawnia pozostałości komórek fluorescencyjnych lub dodatkowe ciała komórkowe, które należy usunąć, powtórz kroki ablacji laserowej, aby utworzyć widoczną lukę w ciągu komórek międzynerwowych.
   2. Sprawdź obraz kanału T-PMT (Transmission Photomultiplier Tube), aby dodatkowo potwierdzić uszkodzenie komórki. Uszkodzone komórki będą miały ziarnisty wygląd, a jądra często pęcznieją lub przybierają nieregularny kształt (Rysunek 2).
4. Po przechwyceniu obrazu przed ablacją, ablacji komórek w razie potrzeby i przechwyceniu obrazu po ablacji dla każdej indywidualnej pozycji etapu, skonfiguruj mikroskopię poklatkową, aktywując zarówno pozycję etapu, jak i opcje czasu przechwytywania obrazu. Ustaw parametry czasu na 24 godziny lub inny żądany punkt końcowy i interwały 15 minut. Rozpocznij eksperyment, aby uzyskać obrazy i zapisać wynikowy plik po zakończeniu (następnego dnia).
5. Jeśli larwy mają być dalej badane lub hodowane, należy je ostrożnie usunąć z agarozy za pomocą drobnych kleszczy, a następnie przenieść je do podłoża E3 bez trikainy w celu odzyskania. Jeśli nie mają być dalej wykorzystywane, poddaj je eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt (powszechną metodą jest szybkie i długotrwałe zanurzenie w kąpieli lodowej) i zutylizuj je zgodnie z wymaganiami instytucji.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12-dołkowe slajdy drukowane z PTFE	Nauki o mikroskopii elektronowej	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricaine in reverse osmosis water
1X E3 + 600 μM Tricaine			Rozcieńczyć 15 mM zapas Trikainy 25X w nośniku 1X E3
1X E3 media			Rozcieńczyć 60X E3 media do 1X w wodzie z odwróconej osmozy (16,7 ml/L)
60 X E3 media	Wszystkie komponenty zakupione od Sigma-Aldrich		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 w 1 litrze wody z odwróconej osmozy
Bx60 Mikroskop złożony z fluorescencją lampy łukowej rtęciowej	Olympus
Mikroskop konfokalny LSM 700 wyposażony w lasery 405 nm, 488 nm oraz 555 lub 561 nm	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Do ablacji użyto lasera o długości fali 5 mW i długości fali 405 nm; Ablacje i obrazowanie przeprowadzono za pomocą 63-krotnego obiektywu planapochromatycznego o współczynniku NA 1,40
FIJI/ImageJ Oprogramowanie do przetwarzania obrazów	Wielu współautorów		Do pobrania pod adresem https://fiji.sc/
Igła do preparowania zmodyfikowana w nóż do włosów	Fisher Scientific	19010	Rzęsa została przyklejona do końca igły do preparowania z drewnianą rękojeścią
Oprogramowanie Microsoft Excel	Microsoft Corp.		Arkusze Google to bezpłatna alternatywa dla Microsoft Excel
Naczynia ze szklanym dnem 35 mm z szkiełkiem nakrywkowym nr 1,5, okno 20 mm	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	szalka Petriego 35 mm, szklane okno 20 mm
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Nisko żelująca agaroza	Sigma Life Science	A9414-256
Corning Netwell Insert z siatką poliestrową 74 um, wkładka 24 mm	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Do pobrania na stronie https://rstudio.com/
SMX-168-BL Mikroskop stereoskopowy	Motic		<
Transfer Pipeta	Fisher Scientific	13-711-7M
Oprogramowanie ZEN	Carl Zeiss Microscopy, LLC

tr style='wysokość:20px;' >