Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Streszczenie

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca²⁺ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)

Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiedni przegląd etyczny zwierząt komitetu.

1.Przygotuj Zmodyfikowano bufor Krebsa.

Wykonaj zmodyfikowany bufor Krebsa tak, aby końcowe stężenia (w mM) składników były następujące: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂, 1,2 MgCl₂, 1,2 NaH₂PO₄, 10 HEPES, 21.2 NaHCO₃²⁺2. Obrazowanie i analiza

UWAGA: Użyj przynajmniej podstawowego zestawu do obrazowania z fluorescencyjnym źródłem światła, mikroskopem, wysokiej jakości kamerą CCD i odpowiednim oprogramowaniem do akwizycji. Różnicuj dodawanie innych składników w zależności od źródła światła i konkretnego zastosowania. Koło filtrowe i przesłona muszą być używane z tradycyjnym ksenonowym źródłem światła łukowego. Jednak źródła światła LED i systemy oświetleniowe nie wymagają tych komponentów.

1. Umieść komorę zapisu pod mikroskopem i za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej z wieloma podgrzewanymi zbiornikami strzykawki ustal ciągłą szybkość perfuzji 2-3 ml/min 37 °C buforu Krebsa. Upewnij się, że nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza zarówno w przewodzie wejściowym, jak i ssawnym podłączonym do odwadniacza.
2. UWAGA: ²⁺2⁺ stany przejściowe w neuronach.
3. UWAGA:²⁺].
   1. Użyj modyfikacji metody opisanej wcześniej przy użyciu ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)tło, gdzie F1 to fluorescencja w dowolnym punkcie, a F0 to fluorescencja bazowa, aby poprawić dokładność oceny. Modyfikacja ta pomaga w redukcji szumów spowodowanych zmianami fluorescencji w preparatach tkankowych, które wykazują ruch warstwy mięśniowej leżącej pod splotem mięśniowo-jelitowym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glukoze	Sigma	G8270
Pinezki do owadów	Dobrze Narzędzia naukowe	Minutien Pins
iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Chlorek potasu	Sigma	P3911
Chlorek magnezu	Sigma	M9272
Chlorek sodu	Sigma	S9888
Diwodorofosforan sodu	Sigma	S8282
Wodorowęglan sodu	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	Andor	Neo 5.5 sCMOS
Nicardipine	Sigma	N7510
Pompa perystaltyczna	Aparat Harvarda	Model 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid	Molekularny Probes	P36400
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
Regulator temperatury	Warner Instruments	TC-344C