Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Streszczenie

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca²⁺ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)

Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiedni przegląd etyczny zwierząt komitetu.

1.Przygotuj Zmodyfikowano bufor Krebsa.

Wykonaj zmodyfikowany bufor Krebsa tak, aby końcowe stężenia (w mM) składników były następujące: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂, 1,2 MgCl₂, 1,2 NaH₂PO₄, 10 HEPES, 21.2 NaHCO₃²⁺2. Obrazowanie i analiza

UWAGA: Użyj przynajmniej podstawowego zestawu do obrazowania z fluorescencyjnym źródłem światła, mikroskopem, wysokiej jakości kamerą CCD i odpowiednim oprogramowaniem do akwizycji. Różnicuj dodawanie innych składników w zależności od źródła światła i konkretnego zastosowania. Koło filtrowe i przesłona muszą być używane z tradycyjnym ksenonowym źródłem światła łukowego. Jednak źródła światła LED i systemy oświetleniowe nie wymagają tych komponentów.

1. Umieść komorę zapisu pod mikroskopem i za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej z wieloma podgrzewanymi zbiornikami strzykawki ustal ciągłą szybkość perfuzji 2-3 ml/min 37 °C buforu Krebsa. Upewnij się, że nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza zarówno w przewodzie wejściowym, jak i ssawnym podłączonym do odwadniacza.
2. UWAGA: ²⁺2⁺ stany przejściowe w neuronach.
3. UWAGA:²⁺].
   1. Użyj modyfikacji metody opisanej wcześniej przy użyciu ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)tło, gdzie F1 to fluorescencja w dowolnym punkcie, a F0 to fluorescencja bazowa, aby poprawić dokładność oceny. Modyfikacja ta pomaga w redukcji szumów spowodowanych zmianami fluorescencji w preparatach tkankowych, które wykazują ruch warstwy mięśniowej leżącej pod splotem mięśniowo-jelitowym.

Materiały