$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Napełnianie astrocytów jonoforezą
- Przetestuj elektrodę.
- Delikatnie umieść plasterek mózgu w naczyniu ze szklanym dnem wypełnionym 0,1 M PBS w temperaturze pokojowej. Przytrzymaj plasterek na miejscu za pomocą platynowej harfy z nylonowymi strunami.
- Upewnij się, że elektroda jest podłączona do źródła napięcia i umieść elektrodę uziemiającą w kąpieli zawierającej wycinek mózgu.
- Przenieś cel do obszaru mózgu, który Cię interesuje.
- Opuść elektrodę do roztworu. Pod jasnym polem przesuń go na środek pola view i dokładnie zbadaj go za pomocą 40-krotnej soczewki zanurzonej w wodzie, aby upewnić się, że jest czysty i bez zanieczyszczeń i pęcherzyków. Jeśli coś zatka końcówkę elektrody, wymień ją na nową.
UWAGA: Zatkanie jest problemem dla elektrody 200 MΩ. Przy odwirowaniu i filtracji roztworu barwnika przed każdym eksperymentem nie powinno to być częstym problemem. Ponieważ jednak końcówka elektrody jest mała, tkanka może czasami utknąć w otworze. Autorzy nie znaleźli sposobu, aby temu zapobiec, ale można sobie z tym łatwo poradzić, po prostu używając nowej elektrody. - Pod jasnym polem powoli opuść elektrodę w kierunku warstwy, zatrzymując się tuż nad powierzchnią.
- Wypełnij astrocyt jonoforezą.
- Zidentyfikuj astrocyty 40−50 μm poniżej powierzchni wycinka za pomocą kontrastu różnicowego interferencji w podczerwieni (IR-DIC). Szukaj komórek z wydłużonymi, owalnymi somatami o średnicy około 10 μm. Po wybraniu astrocytu przesuń go na środek pola widzenia.
UWAGA: Dobra komórka do jonoforezy ma wokół siebie wyraźne, wyraźne granice. Nie wybieraj komórek zbyt blisko powierzchni plasterka, ponieważ nie można ich całkowicie wypełnić. Potrzeba trochę praktyki w ciągu kilku dni, aby móc rutynowo identyfikować astrocyty do wypełnienia barwnikiem. W zależności od obszaru mózgu użytego w eksperymencie, liczba astrocytów może się różnić. Może to wpłynąć na czas potrzebny do zidentyfikowania astrocytu przed wypełnieniem. - Powoli opuść końcówkę elektrody do wycinka, poruszając się po tkance, aż znajdzie się na tej samej płaszczyźnie co ciało komórki.
UWAGA: Przesuwaj elektrodę powoli, aby uniknąć uszkodzenia tkanki. - Gdy ciało komórki astrocytu jest wyraźnie widoczne i zarysowane, powoli i delikatnie przesuwaj elektrodę do przodu. Przesuwaj elektrodę, aż końcówka przebije somę ogniwa. Powoli przesuwaj ostrość obiektywu w górę iw dół, aby zauważyć, czy elektroda znajduje się wewnątrz somy.
UWAGA: Końcówka elektrody musi znajdować się wewnątrz korpusu komórki i należy zwrócić uwagę na małe wgłębienie na somie. Nie przesuwaj elektrody dalej, aby uniknąć przechodzenia końcówki przez ogniwo. - Gdy końcówka elektrody znajdzie się wewnątrz ogniwa, włącz stymulator przy napięciu ~0,5−1 V i w sposób ciągły wyrzucaj prąd do ogniwa. Za pomocą mikroskopu konfokalnego obserwuj, jak komórka się wypełnia. Zwiększ zoom cyfrowy, aby zobaczyć szczegóły ogniwa i upewnij się, że końcówka elektrody jest widoczna wewnątrz ogniwa.
UWAGA: Zmniejsz napięcie, jeśli wydaje się, że barwnik wycieka z ogniwa lub wypełnia inne komórki w pobliżu. Jeśli wydaje się, że barwnik nadal wycieka z ogniwa, powoli wyciągnij elektrodę i znajdź inne ogniwo. Ważne jest, aby barwnik nie przeciekał, aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do tła na końcowym obrazie. - Odczekaj około 15 minut, aż drobniejsze gałęzie i procesy pojawią się zdefiniowane, wyłącz napięcie i delikatnie wyjmij końcówkę elektrody z ogniwa.
- Zobrazuj wypełnioną komórkę.
UWAGA: Obrazowanie można wykonać natychmiast po wypełnieniu. Obiektyw z większą aperturą numeryczną (NA) zapewnia lepszą rozdzielczość. - Poczekaj, aż komórka powróci do swojej pierwotnej postaci przed obrazowaniem (15−20 min) za pomocą obiektywu 40x. Aby zobrazować komórkę, dostosuj ustawienie konfokalnej, aby upewnić się, że drobniejsze gałęzie i procesy wydają się zdefiniowane.
- Skonfiguruj stos z krokiem o rozmiarze 0,3 μm. Podczas obrazowania przesuwaj obiektyw, aż nie będzie sygnału z komórki i ustaw go jako górę. Następnie przesuń obiektyw w dół (skupiając się przez komórkę), aż nie będzie sygnału, ustaw go jako dół.