Osadzenie mózgu Drosophila w matrycy w celu obrazowania poklatkowego neuronów zegara okołodobowego

Streszczenie

Źródło: Sabado, V., et al., }Nagoshi, E. Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki Drosophila Zegary okołodobowe w mózgu larw Kultura. J. Vis. exp. (2018).

Ten film demonstruje procedurę osadzania mózgu Drosophila{} w matrycy fibryny, a następnie obrazowanie fluorescencyjne poklatkowe neuronów zegara okołodobowego w celu analizy rytmicznej aktywności zsynchronizowanej z cyklami światła/ciemności.

Protokół

1. Osadzenie eksplantatów mózgu w matrycy 3D i montaż (~20 min).
   1. Zanurz wypreparowany mózg w roztworze roboczym fibrynogenu (końcowe stężenie fibrynogenu ~ 3,3 mg / ml, 10,5 μl na mózg) w następujący sposób:
   2. Odsysać 3,5 μl pożywki aktywnej Schneidera (SAM)/antybiotyków. Odessać wypreparowany mózg z sekcji do tej samej końcówki pipety bez dozowania pożywki SAM/antybiotyków do końcówki.
   3. Dozuj mózg i pożywkę na pokrywkę sterylnej szalki Petriego. Dodać kolejne 3,5 μl SAM/antybiotyków i 3,5 μl ciepłego roztworu fibrynogenu/SAM 10 mg/ml do kropli zawierającej mózg. Delikatnie wymieszać roztwór wokół mózgu, pipetując końcówką do pipety o pojemności 20 μl.
      UWAGA: Używanie pipety zamiast kleszczy na tym etapie pozwala uniknąć stresu mózgu.
   4. Weź 2 μl roztworu roboczego fibrynogenu z kropli i nałóż go jako małe kółko na szkiełko nakrywkowe naczynia ze szklanym dnem. Dodać 0,8 μl trombiny i bardzo szybko wymieszać końcówką pipety. Fibrynogen przekształca się w fibrynę i zaczyna polimeryzować.
   5. Weź mózg, który znajduje się w roztworze roboczym fibrynogenu (krok 1.1) między parą kleszczy i umieść go na matrycy, gdy widoczna jest biała matryca fibryny. Zorientuj mózg przednią stroną do dołu (do obrazowania neuronów zegarowych). Dociśnij go jak najbliżej szkła nakrywkowego. Skrzep fibryny składa się z warstw fibryny. Wybierz jedną warstwę i złóż ją na mózgu małymi i delikatnymi ruchami, nie odrywając matrycy.
      1. Powtórz 2 do 3 razy z różnych części skrzepu, aby ustabilizować mózg.
         UWAGA: Podczas obchodzenia się z mózgiem za pomocą kleszczy, uważaj, aby go nie wysuszyć ani nie wywierać na niego fizycznego stresu.
   6. Dodaj 20 μl SAM/antybiotyków na wierzch osadzonego mózgu, aby zatrzymać działanie trombiny.
   7. Powtórz procedurę, aby zamontować pozostałe mózgi. W naczyniu ze szklanym dnem można umieścić od pięciu do sześciu mózgów.
   8. W przypadku długotrwałego obrazowania na żywo dodaj 600 μl SAM/antybiotyków do wewnętrznej studzienki (szklanej części). Umieść wstępnie przyciętą membranę z politetrafluoroetylenu (PTFE) na wierzchu podłoża i przyklej ją do smaru próżniowego nałożonego na plastikową część dna (Rysunek 1A).

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Nie jestem pewien, czy są to dokładnie te same, które mamy w laboratorium. Wybrałem "odpowiedni do hodowli komórek owadów", gdy tylko jest dostępny
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) Glucose<	G7021
Ekstrakt z drożdży	Sigma-Aldrich	Y1000
Insulina	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
Penicylina-streptomycyna<	P4333<
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429
L-(−)-Kwas jabłkowy	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-Trehaloza dihydrate	Sigma-Aldrich	T0167
Kwas bursztynowy	Sigma-Aldrich	S9512
Kwas fumarowy	Sigma-Aldrich	F8509
α-ketoglutarowy	Sigma-Aldrich	K1128
Nieinaktywowana termicznie, surowica cielęca płodu (FCS) przebadana pod kątem mykoplazmy i wirusa	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7,4	Produkty naukowe E&K	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S7903
Fibrynogen z osocza bydlęcego	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	UWAGA: Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Manipuluj pod przepływem laminarnym
Trombina z osocza bydlęcego	Sigma-Aldrich	T9549	UWAGA: Zagrożenie dla zdrowia, używaj rękawiczek
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	custom made
Smar próżniowy	Sigma-Aldrich	18405
35 mm talerz, nr 1.5 szkiełko nakrywkowe, 20 mm średnica szkła, niepowlekany	MatTek	P35G-1.5-20-C
Naczynia do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip	Fisherscientific	08-772A
Sterylny filtr butelkowy z gwintem 500 ml Steritop-GP 33 mm, 0,22 μm	Millipore	SCGPS05RE
Folia z politetrafluoroetylenu (PTFE)	Dupont	200A Teflon FEP Film
Millex-HV Filtr strzykawkowy, 0,45 μm, PVDF, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma	Millipore	SLHV033RS
Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma	Millipore	SLGV033RS
Trzydołkowa szklana miska do wycinku	Any company
Cienkie kleszcze, rozmiar 5, Dumont	Narzędzia do nauki	11254-20
Tandem skaner odwrócony mikroskop konfokalny TCS SP5, ze skanerem rezonansowym i detektorami fotopowielacza HyD	Leica microsystem CMS GmbH
Komora kontroli temperatury	Usługi obrazowania życia	System kontroli temperatury CUBE & BOX, specjalnie zaprojektowany
Stage-top regulator wilgotności	Usługi obrazowania życia	custom made
Mikrodozownik zanurzenia w wodzie: dozownik, rozszerzona seria MP6 z mikropompą i oprogramowanie do automatycznego kontrolera obiektywów	Leica microsystem CMS GmbH
Wtyczka do tworzenia stosu SUM i dryfu korekcji 3D	ImageJ software
10x iteracyjna dekonwolucja	Oprogramowanie AutoQuant i Imaris

3td style='kolor tła:#ffffff;kolor:#1a202c;rodzina czcionek:Roboto;rozmiar czcionki:12pt;grubość czcionki:normalny;przepełnienie:ukryte;wypełnienie:0px 3px;wyrównanie w pionie:dół;biały-spacja:normalny;zawijanie słów:break-word;strategia zawijania:4;'>Sigma-Aldrichtd style='kolor tła:#ffffff;kolor:#1a202c;rodzina czcionek:Roboto;rozmiar czcionki:12pt;grubość czcionki:normalny;przepełnienie:ukryte;wypełnienie:0px 3px;wyrównanie w pionie:dół;biała przestrzeń:normalna;zawijanie słów:break-word;strategia zawijania:4;'>Sigma-Aldrichtd style='kolor tła:#ffffff;przepełnienie:ukryte;dopełnienie:0px 3px;wyrównanie w pionie:dół;'>