Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

Streszczenie

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca^2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020)

{{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i indukowanej przez neuroprzekaźniki aktywności wapnia.

Protokół

1. Posiewanie komórek

UWAGA: Bazując na doświadczeniu, pobiera się około 100 000 żywotnych komórek na zarodek. 2-3-miesięczne myszy w ciąży mają zazwyczaj miot o wielkości 8-10 zarodków; dlatego przybliżone oszacowanie całkowitej wydajności komórek na ciężarną mysz wynosi około 1 miliona komórek.

1. Za pomocą hemocytometru wykonaj liczenie komórek, a następnie rozcieńcz zawiesinę do 2,000 komórek/μL za pomocą pożywki do hodowli komórkowych. Krótko rozcierać, aby wymieszać.
2. Usunąć szkiełka nakrywkowe z roztworem lamininy z inkubatora i odessać pozostały roztwór lamininy z powlekanych szkiełek nakrywkowych za pomocą próżni. Płytkować szybko, aby uniknąć całkowitego wyschnięcia szkiełek nakrywkowych. Odpipetować 100 μl (2,0 x 10⁵ komórek/szkiełko nakrywkowe) na każde szkiełko nakrywkowe i umieścić szalki Petriego w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
3. Ostrożnie dodaj 3 ml pożywki do hodowli komórkowych do każdej pożywki i umieść z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Połówka podłoża zmienia się 2 razy w tygodniu przez 2 tygodnie.

2. Zakażenie hodowli komórkowej po 14 (dniach in vitro) DIV wektorami wirusowymi (AAV) związanymi z adenowirusem

1. Dla każdego dania przygotuj 1 ml pożywki DMEM wolnej od surowicy z 1 μL hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x^{10 13} miana)
2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej z każdej szalki i zastąpić 1 ml wolnego od surowicy zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) zawierającego hSyn-GCaMP6f. Umieść naczynia z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
3. Odessać pożywkę wolną z surowicy zawierającą AAV i zastąpić ją 3 ml pożywki do hodowli komórkowych. Umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Odkryliśmy, że 5-7 dni infekcji AAV pozwala na uzyskanie idealnego poziomu ekspresji GCaMP. Kontynuuj zmianę pożywki co 2-3 dni przez cały okres infekcji wirusowej.

3. Obrazowanie konfokalne Ca²⁺ na żywo między 19-21 dniami in vitro (DIV)

UWAGA: Obrazowanie można wykonać w ciągu 5-7 dni po infekcji wirusowej. Jest to idealne okno do osiągnięcia widocznej ekspresji fluoroforu na poziomach, które pozwalają na wykrycie spontanicznej aktywności Ca²⁺.

1. Przygotowanie buforów do nagrywania
   1. Aby zrobić 1 L bufora nagrywającego HEPES, dodaj: 9,009 g NaCl, 0,3728 g KCl, 0,901 g D-glukozy, 2,381 g kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 2 ml 1 M roztworu podstawowego CaCl₂ i 500 μl roztworu podstawowego 1 M MgCl₂ do 800 ml sterylnego destylowanego H₂O. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą NaOH. Doprowadzić do końcowej objętości 1 l.
   2. Aby uzyskać 200 ml buforu zapisującego glutaminian 20 μM, rozcieńczyć 40 μL 100 mM roztworu podstawowego glutaminianu w 200 ml bufora zapisującego HEPES opisanego powyżej.
2. Confocal imaging
   1. Napełnij sterylną szalkę Petriego o średnicy 35 mm 3 ml bufora rejestrującego.
   2. Usuń 35-milimetrową szalkę Petriego z zainfekowanymi kulturami z inkubatora w temperaturze 37 °C. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie chwyć krawędź jednego szkiełka nakrywkowego i szybko przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną buforem nagrywającym. Umieścić pozostałe szkiełko nakrywkowe w podłożu z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 °C. Przetransportować szalkę z buforem rejestrującym do mikroskopu konfokalnego.
   3. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Przejdź do następnego kroku podczas inicjalizacji.
   4. Uruchom pompę perystaltyczną i umieść linię w buforze nagrywania. Skalibruj prędkość przepływu na 2 ml/min.
   5. Przenieś zainfekowane szkiełko nakrywkowe z płytki Petriego o średnicy 35 mm do kąpieli nagraniowej.
   6. Korzystając z 10-krotnego obiektywu zanurzenia w wodzie i światła jasnego pola (BF), znajdź płaszczyznę ostrości i poszukaj obszaru o dużej gęstości ciał komórek neuronowych. Przełącz się na obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie i użyj światła BF, aby ponownie ustawić ostrość próbki.
   7. W oknie "Lista barwników" w FluoView wybierz AlexaFluor 488 i zastosuj go.
   8. Wyrażenia AAV mogą być zmienne; dlatego, aby zapobiec prześwietleniu i fotowybielaniu fluoroforów, zacznij od niskich ustawień HV i mocy lasera. Dla kanału AlexaFluor 488 ustaw wysokie napięcie (HV) na 500, wzmocnienie na 1x i przesunięcie na 0. Dla linii laserowej 488 ustaw moc na 5%. Aby zwiększyć efektywną objętość obrazowaną w płaszczyźnie z, zwiększ rozmiar otworu do 300 μm. Użyj opcji skanowania "focus x2", aby optymalnie dostosować sygnały emisji do poziomów niepełnego nasycenia. Z tego miejsca ustawienia można dostosowywać, aż do uzyskania idealnej widoczności każdego kanału.
      UWAGA: Aby dokładnie uchwycić pełny zakres strumieni Ca²⁺ za pomocą GCaMP, dostosuj podstawowe ustawienia HV i mocy lasera, aby umożliwić wzrost intensywności fluorescencji bez przesycania detektora.
   9. Po zoptymalizowaniu ustawień mikroskopu, przesuń stolik, aby zlokalizować obszar z wieloma komórkami wykazującymi spontaniczne zmiany fluorescencji GCaMP6f i ustaw ostrość na żądaną płaszczyznę obrazowania.
   10. Użyj narzędzia "Przytnij prosto", aby przyciąć ramkę do rozmiaru, który może osiągnąć odstęp między klatkami nieco poniżej 1 sekundy. Jest to konieczne, aby ustawić interwał obrazowania na 1 klatkę na sekundę.
   11. Ustaw okno "Interwał" na wartość 1.0, a okno "Num" na 600.
       UWAGA: Aby dostarczyć różne bufory nagrywania w żądanym punkcie czasowym (300 s), ważne jest, aby skalibrować opóźnienie pompy, aby dostarczyć nowy roztwór do kąpieli. Będzie to zależało od szybkości perfuzji roztworu (2 ml/min) i długości przewodu używanego do pompowania roztworu.
   12. Aby nagrać film z serii t, wybierz opcję "Czas", a następnie użyj opcji skanowania "XYt", aby rozpocząć obrazowanie.
   13. Obserwuj pasek postępu obrazowania i przesuń linię z bufora zapisu HEPES do bufora zapisu glutaminianu 20 μM w odpowiednim punkcie czasowym (np. jeśli opóźnienie pompy jest skalibrowane tak, aby dostarczać roztwór po 60 sekundach, przesuń linię do bufora glutaminianu po 240 klatkach, aby dostarczyć glutaminian po 300 sekundach).
   14. Po zakończeniu obrazowania wybierz przycisk Seria Zakończona i zapisz gotowy film z serii t. Kontynuuj perfuzję 20 μM glutaminianu przez dodatkowe 5 minut, tak aby hodowane neurony były wystawione na działanie glutaminianu przez łącznie 10 minut. Powtórz ten proces dla każdego szkiełka nakrywkowego, które ma być zobrazowane.
   15. Po dodatkowych 5 minutach ekspozycji na glutaminian 20 μM, usuń szkiełko nakrywkowe z kąpieli i umieść z powrotem na szalce Petriego o średnicy 35 mm zawierającej bufor zapisu, aż do zakończenia dnia obrazowania.

Materiały