Obrazowanie wapnia in vitro w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów

Streszczenie

Źródło: Calvo-Rodríguez, et al. Obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne subkomórkowego Ca²⁺ w starzejących się neuronach hipokampa. J. vis. exp. (2015).

Ten film demonstruje zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego do pomiaru poziomu cytozolowego wapnia w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów. Porównując młode i starzejące się neurony, podkreśla, w jaki sposób zwiększona gęstość kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu L i przedłużona aktywacja w starzejących się neuronach powodują przeciążenie wapniem, co jest cechą charakterystyczną starzenia się neuronów. Fluorescencyjne wskaźniki wapnia ujawniają te różnice poprzez zmiany intensywności fluorescencji po stymulacji.

Protokół

1. Krótko- i długoterminowa hodowla neuronów hipokampa u szczurów

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych z poli-D-lizyny, 12 mm szklanych szkiełek nakrywkowych.
   1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm sterylizować w etanolu przez co najmniej 24 godziny. Pozostaw je do wyschnięcia w sterylnych warunkach.
   2. Rozprowadzić szkiełka nakrywkowe na pasku parafilmu na szalce Petriego. Pokryć powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego 200 μl poli-D-lizyny o stężeniu 1 mg/ml. Pozostawić na noc (O/N).
   3. Następnego dnia myj szkiełka nakrywkowe podwójnie destylowaną sterylną wodą co 15 minut przez 90 minut w sterylnych warunkach.
   4. Napełnij czterodołkową płytkę wielotalerzową 500 μl pożywki do hodowli neuropodstawowej na studzienkę. Pożywkę Neurobasal Culture Breeding należy uzupełnić o 10% płodową surowicę bydlęcą, 2% witaminy B27, 1 μg/ml gentamycyny i 2 mM L-glutaminy.
   5. Umieść szkiełka nakrywkowe na talerzu wielotalerzowym. Utrzymuj je w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 ºC i 5% CO₂ do momentu użycia.
2. Izolacja neuronów hipokampa od nowonarodzonych szczurów.
   1. Przygotować 1,8 ml roztworu papainy (zakupionego bezpośrednio) w fiolce (20 μl/ml) w sterylnych warunkach: Aby uzyskać końcowe stężenie 20 μl/ml dodać około 40 μl papainy do 1,8 ml albuminy surowicy bydlęcej Hank's plus 0,6% (BSA, μl należy obliczyć w zależności od warunków dostawcy). Hank's 0,6% BSA przygotowuje się przez zmieszanie 85 ml pożywki Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) z 15 ml 4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA, przygotowana roztworem 4 g BSA w 100 ml HBSS). Przygotuj go w sterylnym kapturze.
   2. Przed użyciem inkubować papainę w Hank's plus 0,6% BSA przez 30 minut w temperaturze 37 ºC. Przed użyciem przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.
   3. Przygotuj pożywkę F-12 firmy Ham, dodając Dulbecco's Modified Eagle's Medium w proszku (13,5 g na litr) w 900 ml podwójnie destylowanej sterylnej wody. Następnie dodać 6 g kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 336 mg NaHCO₃ i dostosować pH do 7,42 za pomocą NaOH 4 N. Dodać sterylną wodę, aby uzyskać 1 l roztworu i przefiltrować go za pomocą filtra butelkowego z polieterosulfonu (PES) o stężeniu 0,20 μm. Przeprowadź ten proces w sterylnym kapturze. Na koniec nasycić roztwór CO₂ w sterylnych warunkach przed użyciem. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C i używać w stanie schłodzonym.
   4. Eutanazja nowonarodzonych (P0) szczeniąt szczurów przez dekapitację i umycie głowy w sterylnym pożywce HBS. Otwórz czaszkę za pomocą sterylnych nożyczek. Wyjmij mózg szpatułką i szybko umyj go w pożywce F-12 Hama.
   5. Wykonaj ukośne cięcie za pomocą skalpela w każdej półkuli (Rysunek 1B) i przenieś go na szalkę Petriego zawierającą pożywkę F-12 Hama.
   6. Opony mózgowe należy ostrożnie wyrzucić za pomocą kleszczy preparacyjnych i pod szkłem powiększającym.
   7. Zidentyfikuj hipokamp w charakterystycznym wklęsłym miejscu nad korą za pomocą szkła powiększającego. Następnie oddziel hipokamp od kory, ostrożnie pociągając za jedną granicę i usuwając ją z pozycji za pomocą nożyczek do oczu.
   8. Przenieś tkankę hipokampa na 4-dołkową płytkę wypełnioną sterylnym podłożem Hanka bez Ca²⁺ i Mg²⁺ plus 0,6% BSA i umyj tkankę hipokampa. Nie usuwając podłoża, pokrój tkankę na małe kawałki (około 2 x 2 mm) za pomocą tych samych nożyczek do oczu.
   9. Przenieść kawałki hipokampa do fiolki zawierającej 1,8 ml wstępnie przefiltrowanego roztworu papainy. Następnie inkubować je w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu delikatnie wstrząsając. 15 minut później dodać 90 μl roztworu DNazy I (50 μg/ml końcowy) i inkubować przez dodatkowe 15 minut.
   10. Przenieś tkankę do probówki wirówkowej o pojemności 10 ml i przemyj fragmenty świeżą pożywką do hodowli neurobazalnej. Zawiesinę komórek uzyskuje się, przepuszczając fragmenty tkanek przez plastikową pipetę o pojemności 5 ml.
   11. Zawiesinę komórek wirowych w dawce 160 x g przez 5 min. Usunąć supernatant za pomocą sterylnej pipety Pasteura z tworzywa sztucznego i ostrożnie zawiesić osad za pomocą automatycznej pipety o pojemności 1 ml w 1 ml pożywki do hodowli neuropodstawowej.
   12. Zmierz gęstość komórek za pomocą komory liczącej Neubauera. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na komorze Neubauera. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej. Upewnij się, że zawiesina komórek dostaje się równomiernie do komory i nie tworzy pęcherzyków. Policz liczbę komórek pod mikroskopem i wykonaj odpowiednie obliczenia, aby uzyskać odpowiednią kroplę 40-80 μl zawierającą 30 x 10 komórek³. Całkowita liczba komórek będzie zależeć od liczby wykorzystanych zwierząt.
3. Krótko- i długoterminowa hodowla neuronów hipokampa szczura.
   1. Na czterodołkowej płytce wielotalerzowej zawierającej 500 μl pożywki do hodowli neurobazalnej, przygotowanej wcześniej i przechowywanej w inkubatorze, rozłożyć około 30 x 10 komórek ³ do każdego dołka płytki wielotalerzowej zawierającej jedną poli-D-lizynę, Szkiełko nakrywkowe szklane o średnicy 12 mm.
   2. Utrzymuj pierwotne komórki hipokampa w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 ºC i 5% CO₂ przez 2-5 dni in vitro (DIV, krótkoterminowe, młode kultury) lub >15 DIV (długoterminowe, kultury poddane starzeniu) przed eksperymentami bez zmiany pożywek hodowlanych.

2. Obrazowanie fluorescencyjne cytozolowego stężenia Ca²⁺ {{}}

1. Przygotowanie roztworów testowych do obrazowania fluorescencyjnego.
   1. Przygotować zewnętrzny roztwór soli fizjologicznej buforowany przez HEPES (HBS) zawierający, w mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, glukoza 10, sód-HEPES 10 (pH 7,42).
   2. Przygotować zewnętrzny, wolny od Mg²⁺, buforowany przez HEPES roztwór soli fizjologicznej (HBS) zawierający w mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl₂ 1, glukozę 10 i HEPES 10 (pH 7,42).
   3. Rozpuścić N-metylo-D-asparaginian (NMDA) w Mg^2+{-wolny, buforowany przez HEPES roztwór soli fizjologicznej (HBS) w końcowym stężeniu 100 μM i uzupełnić go 10 μM glicyną.
   4. Przygotować roztwór HBS zawierający KCl zamiast NaCl, rozpuszczając (w mM): KCl 145, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, glukoza 10 i HEPES 10 (pH 7,42).
2. Ładowanie komórek hipokampa fluorescencyjną sondą wapniową fura2/AM.
   1. Zdjąć z inkubatora hodowlę komórkową zawierającą szkiełka nakrywkowe i przemyć je pożywką HBS w temperaturze pokojowej (RT), przenosząc je na nową czterodołkową płytkę wielotalerzową zawierającą 500 μl HBS na studzienkę.
   2. Inkubować komórki z fura2/AM 4 μM (przygotowanym w tej samej pożywce HBS) przez 60 minut w temperaturze pokojowej (25 °C) w ciemnym miejscu.
   3. Po 60 minutach zmyć szkiełka nakrywkowe świeżym podłożem HBS.
3. Rejestrowanie obrazów fluorescencyjnych cytozolu [Ca²⁺] w hodowanych komórkach.
   1. Włącz lampę, mikroskop, system perfuzyjny, kamerę fluorescencyjną i komputer.
   2. Umieść szkiełka nakrywkowe na termostatycznej platformie dla otwartych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm na stoliku mikroskopu odwróconego i wybierz pole mikroskopowe za pomocą obiektywu 40X (olej, apertura numeryczna [NA]:1.3). Perfuzjować komórki w sposób ciągły za pomocą wstępnie ogrzanej (37 °C) pożywki HBS przy braku lub w obecności substancji badanych. Utrzymuj przepływ z prędkością około 5-10 ml/min.
      Uwaga: System perfuzji komórek dla żywych komórek jest zamontowany na termostatowanej platformie dla otwartych szklanych szkiełek nakrywkowych o grubości 12 mm. Do perfuzji roztworów służy 8-liniowy grawitacyjny system perfuzyjny wyposażony w sterownik zaworu. Pompa próżniowa jest odpowiedzialna za usuwanie nadmiaru medium. Roztwory są podgrzewane za pomocą systemu grzewczego w rurze.
   3. Przechwyć obraz tła z zamkniętą migawką na obu długościach fal wzbudzenia.
   4. Epi-illuminate komórki na przemian przy 340 i 380 nm. Rejestruj światło emitowane o długości fali 520 nm co 5-10 sekund za pomocą kamery fluorescencyjnej, która jest filtrowana przez zwierciadło dichroiczne fura-2.
   5. Po zakończeniu okresu nagrywania zapisz w komputerze całą sekwencję obrazów emitowanych przy długości fali 520 nm w celu dalszej analizy.
4. Analiza zarejestrowanych obrazów fluorescencyjnych.
   1. Otwórz plik eksperymentu. Korzystając z oprogramowania aquacosmos, kliknij "Stosunek" i wybierz żądany zakres proporcji. Oblicz stosunek piksel po pikselu w wynikowych obrazach, aby uzyskać sekwencję obrazów o proporcjach.
   2. Odejmij tło, dostosowując "eliminację tła". Naciśnij "rozpocznij obliczenia".
   3. Naciśnij przycisk "cała sekwencja czasu" i usuń starożytne obszary zainteresowania (ROI). W celu analizy ilościowej poszczególnych komórek ustal nowe obszary zainteresowania lub ROI odpowiadające poszczególnym neuronom. Uśrednij wszystkie wartości współczynnika w każdym pikselu odpowiadające każdemu ROI i każdemu obrazowi, aby uzyskać zapis wartości fluorescencji proporcji dla poszczególnych ROI (komórek).
   4. Aby narysować wykresy poszczególnych nagrań, wyeksportuj wartości fluorescencji współczynnika odpowiadające każdemu zwrotowi z inwestycji do programu do tworzenia wykresów.
   5. Wykonaj odpowiednie obliczenia w celu oszacowania wielkości wzrostu współczynnika fluorescencji w odpowiedzi na każdą stymulację, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco
DNase I (z trzustki bydlęcej)	Sigma	D5025-15KU
Serum bobinowe płodu	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamycyna	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm szklane szkiełka nakrywkowe	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well tabliczki wielotalerzowe	Nunc	176740
Petri's Petri	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterylne pipety	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Mikroskop telewizyjny Zeiss Axiovert S100	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
Kamera fluorescencyjna ORCA ER	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B ogrzewanie system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics