Obrazowanie blaszek beta-amyloidowych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą znakowania immunologicznego i barwienia kurkuminą

Streszczenie

Źródło: Maiti, P. et. al.,. Znakowanie i obrazowanie blaszek amyloidowych w tkance mózgowej przy użyciu naturalnej kurkuminy polifenolowej. J. Vis. exp. (2019)

Ten film przedstawia procedurę obrazowania blaszek beta-amyloidowych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą znakowania immunologicznego i barwienia kurkuminą. Znakowanie immunologiczne zapewnia swoistość dla beta-amyloidu, podczas gdy kurkumina selektywnie wiąże włókienka bogate w β arkusze, poprawiając wizualizację. Kolokalizacja czerwonej i zielonej fluorescencji potwierdza obecność blaszek miażdżycowych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

{{TAG_ 16}}1. Perfuzja zwierząt

1. Przygotuj bufory utrwalające i perfuzyjne.
   1. Przygotować 0,1 M bufor fosforanu sodu, dodając 80 g chlorku sodu (NaCl), 2 g chlorku potasu (KCl), 21,7 g wodorofosforanu disodowego (Na₂HPO₄·7H₂O), 2,59 g diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄) i podwójnie destylowana woda, aby uzyskać łącznie 1 L.
   2. Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA).
      1. Dodać 40 g paraformaldehydu do 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (0,1 M, pH 7,4).
      2. Podgrzać roztwór PFA do temperatury 60−65 °C i wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego.
         UWAGA: Temperatura nie powinna przekraczać 65 °C.
      3. Dodaj kilka kropli wodorotlenku sodu (NaOH) (1 N) za pomocą zakraplacza, aby całkowicie rozpuścić PFA.
      4. Przefiltruj roztwór PFA za pomocą średniej lub drobnej bibuły filtracyjnej i przechowuj w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: Roztwór jest dobry przez miesiąc.
2. Wykonaj znieczulenie zwierzęce i perfuzję.
   UWAGA: Dwunastomiesięczne B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x rodzinna choroba Alzheimera (5×FAD)) myszy kontrolne w tym samym wieku (n = 6 na grupę) zostały zakupione od sprzedawców i wyhodowane w domu dla zwierząt Uniwersytetu Stanowego Saginaw Valley. Genotypowanie potwierdzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Ludzka tkanka mózgowa Choroba Alzheimera (AD) obejmuje pośmiertną tkankę mózgową AD i tkankę kontrolną dopasowaną do wieku.
   1. Znieczulić zwierzę odpowiednim środkiem znieczulającym, takim jak pentobarbital sodu (390 mg/kg masy ciała) lub mieszanina ketaminy/ksylazyny (do 80 mg/kg masy ciała ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (igła 27 g i strzykawka 1 ml). Sprawdź poziom znieczulenia, szczypiąc palec u nogi. Jeśli zwierzę nie reaguje, jest gotowe do operacji perfuzji.
   2. Umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na tacce do operacji perfuzji i za pomocą małych nożyczek do tęczówki wykonaj nacięcie na tylnym końcu lewej komory.
   3. Włóż igłę perfuzyjną 22-G do lewej komory i wykonaj małe nacięcie w prawej małżowinie usznej, aby usunąć płyn perfuzyjny z organizmu. Użyj grawitacyjnego systemu perfuzyjnego, aby umożliwić przepływ lodowatego płynu perfuzyjnego (0,1 M PBS, pH 7,4) przez 5-6 minut (natężenie przepływu 20-25 ml / min).
      UWAGA: Czysta wątroba jest wskaźnikiem optymalnej perfuzji.
   4. Przełącz zawór buforowy na lodowaty 4% roztwór paraformaldehydu w celu utrwalenia i pozwól mu płynąć przez 8−10 minut.
      UWAGA: Drżenie, po którym następują stwardniałe lub sztywne kończyny, jest wskaźnikiem dobrej fiksacji.
   5. Usuń mózg z czaszki za pomocą nożyczek. Za pomocą szpatułki zebrać mózg i umieścić go w fiolce zawierającej 4% PFA (co najmniej 10 razy większa objętość mózgu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

2. Przetwarzanie tkanek

1. Wycinanie sekcji kriostatu.
   1. Przenieść mózg do stopniowanych roztworów sacharozy (10%, 20% i 30%) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny każdy, aż do użycia.
   2. Za pomocą kriostatu w temperaturze -22 °C wyciąć odcinki o grubości 40 μm. Zebrać 10-20 skrawków na studzienkę na 6-dołkowej płytce wypełnionej PBS i azydkiem sodu (0,02%).

3. Kolokalizuj cur(kurkumina) z przeciwciałem Aβ w płytkach Aβ i oligomerach.

1. Przemyć skrawki kriostatu z kroku 2.1.2 za pomocą PBS 3x w płytce 12-dołkowej.
2. Zablokuj skrawki 10% normalną surowicą kozią (NGS) rozpuszczoną w PBS z 0,5% Triton-X-100 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Odrzuć roztwór blokujący. Inkubować skrawki z przeciwciałami specyficznymi dla beta-amyloidu (Aβ) (6E10 lub A11, rozcieńczonymi w stosunku 1:200) rozpuszczonymi w świeżym roztworze blokującym zawierającym 10% NGS i 0,5% Triton-X100 przez noc w temperaturze 4 °C w wytrząsarce przy 150 obr./min.
4. Wyrzucić roztwór przeciwciała i przemyć skrawki PBS 3x przez 10 minut każda.
5. Inkubować z drugorzędowym znacznikiem przeciwciała z czerwonym fluoroforem (np. Alexa
6. 594) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Myć PBS 3x przez 10 min każdy.
8. Umyć 70% alkoholem 1x.
9. Inkubować skrawki z kurkuminą (Cur (10 μM)) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
10. Myć 70% alkoholem 3x po 1 min.
11. Odwodnić 90% i 100% alkoholem przez 1 minutę każde, oczyścić ksylenem 2x przez 5 minut i zamontować na szkiełkach za pomocą plastyfikator distyrenowy ksylen (DPX).
12. Wizualizacja za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami wzbudzenia/emisji dla sygnałów czerwonego i zielonego.

Materiały