Obrazowanie blaszek beta-amyloidowych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą znakowania immunologicznego i barwienia kurkuminą

Streszczenie

Źródło: Maiti, P. et. al.,. Znakowanie i obrazowanie blaszek amyloidowych w tkance mózgowej przy użyciu naturalnej kurkuminy polifenolowej. J. Vis. exp. (2019)

Ten film przedstawia procedurę obrazowania blaszek beta-amyloidowych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą znakowania immunologicznego i barwienia kurkuminą. Znakowanie immunologiczne zapewnia swoistość dla beta-amyloidu, podczas gdy kurkumina selektywnie wiąże włókienka bogate w β arkusze, poprawiając wizualizację. Kolokalizacja czerwonej i zielonej fluorescencji potwierdza obecność blaszek miażdżycowych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

{{TAG_ 16}}1. Perfuzja zwierząt

1. Przygotuj bufory utrwalające i perfuzyjne.
   1. Przygotować 0,1 M bufor fosforanu sodu, dodając 80 g chlorku sodu (NaCl), 2 g chlorku potasu (KCl), 21,7 g wodorofosforanu disodowego (Na₂HPO₄·7H₂O), 2,59 g diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄) i podwójnie destylowana woda, aby uzyskać łącznie 1 L.
   2. Przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA).
      1. Dodać 40 g paraformaldehydu do 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (0,1 M, pH 7,4).
      2. Podgrzać roztwór PFA do temperatury 60−65 °C i wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego.
         UWAGA: Temperatura nie powinna przekraczać 65 °C.
      3. Dodaj kilka kropli wodorotlenku sodu (NaOH) (1 N) za pomocą zakraplacza, aby całkowicie rozpuścić PFA.
      4. Przefiltruj roztwór PFA za pomocą średniej lub drobnej bibuły filtracyjnej i przechowuj w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: Roztwór jest dobry przez miesiąc.
2. Wykonaj znieczulenie zwierzęce i perfuzję.
   UWAGA: Dwunastomiesięczne B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x rodzinna choroba Alzheimera (5×FAD)) myszy kontrolne w tym samym wieku (n = 6 na grupę) zostały zakupione od sprzedawców i wyhodowane w domu dla zwierząt Uniwersytetu Stanowego Saginaw Valley. Genotypowanie potwierdzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Ludzka tkanka mózgowa Choroba Alzheimera (AD) obejmuje pośmiertną tkankę mózgową AD i tkankę kontrolną dopasowaną do wieku.
   1. Znieczulić zwierzę odpowiednim środkiem znieczulającym, takim jak pentobarbital sodu (390 mg/kg masy ciała) lub mieszanina ketaminy/ksylazyny (do 80 mg/kg masy ciała ketaminy i 10 mg/kg masy ciała ksylazyny) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (igła 27 g i strzykawka 1 ml). Sprawdź poziom znieczulenia, szczypiąc palec u nogi. Jeśli zwierzę nie reaguje, jest gotowe do operacji perfuzji.
   2. Umieść znieczulone zwierzę w pozycji leżącej na tacce do operacji perfuzji i za pomocą małych nożyczek do tęczówki wykonaj nacięcie na tylnym końcu lewej komory.
   3. Włóż igłę perfuzyjną 22-G do lewej komory i wykonaj małe nacięcie w prawej małżowinie usznej, aby usunąć płyn perfuzyjny z organizmu. Użyj grawitacyjnego systemu perfuzyjnego, aby umożliwić przepływ lodowatego płynu perfuzyjnego (0,1 M PBS, pH 7,4) przez 5-6 minut (natężenie przepływu 20-25 ml / min).
      UWAGA: Czysta wątroba jest wskaźnikiem optymalnej perfuzji.
   4. Przełącz zawór buforowy na lodowaty 4% roztwór paraformaldehydu w celu utrwalenia i pozwól mu płynąć przez 8−10 minut.
      UWAGA: Drżenie, po którym następują stwardniałe lub sztywne kończyny, jest wskaźnikiem dobrej fiksacji.
   5. Usuń mózg z czaszki za pomocą nożyczek. Za pomocą szpatułki zebrać mózg i umieścić go w fiolce zawierającej 4% PFA (co najmniej 10 razy większa objętość mózgu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

2. Przetwarzanie tkanek

1. Wycinanie sekcji kriostatu.
   1. Przenieść mózg do stopniowanych roztworów sacharozy (10%, 20% i 30%) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny każdy, aż do użycia.
   2. Za pomocą kriostatu w temperaturze -22 °C wyciąć odcinki o grubości 40 μm. Zebrać 10-20 skrawków na studzienkę na 6-dołkowej płytce wypełnionej PBS i azydkiem sodu (0,02%).

3. Kolokalizuj cur(kurkumina) z przeciwciałem Aβ w płytkach Aβ i oligomerach.

1. Przemyć skrawki kriostatu z kroku 2.1.2 za pomocą PBS 3x w płytce 12-dołkowej.
2. Zablokuj skrawki 10% normalną surowicą kozią (NGS) rozpuszczoną w PBS z 0,5% Triton-X-100 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Odrzuć roztwór blokujący. Inkubować skrawki z przeciwciałami specyficznymi dla beta-amyloidu (Aβ) (6E10 lub A11, rozcieńczonymi w stosunku 1:200) rozpuszczonymi w świeżym roztworze blokującym zawierającym 10% NGS i 0,5% Triton-X100 przez noc w temperaturze 4 °C w wytrząsarce przy 150 obr./min.
4. Wyrzucić roztwór przeciwciała i przemyć skrawki PBS 3x przez 10 minut każda.
5. Inkubować z drugorzędowym znacznikiem przeciwciała z czerwonym fluoroforem (np. Alexa
6. 594) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
7. Myć PBS 3x przez 10 min każdy.
8. Umyć 70% alkoholem 1x.
9. Inkubować skrawki z kurkuminą (Cur (10 μM)) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
10. Myć 70% alkoholem 3x po 1 min.
11. Odwodnić 90% i 100% alkoholem przez 1 minutę każde, oczyścić ksylenem 2x przez 5 minut i zamontować na szkiełkach za pomocą plastyfikator distyrenowy ksylen (DPX).
12. Wizualizacja za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi filtrami wzbudzenia/emisji dla sygnałów czerwonego i zielonego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zwierzęcy model choroby Alzheimera	Laboratorium Jacksona, Bar Harbor, ME
Alkohol absolutny	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX
Przeciwciało 6E10	Biolegend, San Diego, Kalifornia<
Przeciwciało A11	Millipore, Burlington, MA
Cryostat	GMI, Ramsey, MN	LeicaCM1800
Curcumin	Sigma, St. Louis, MO
Wodorofosforan disodowy	Sigma, St. Louis, MO
Plastyfikator dystyrenu ksylen	BDH, Dawsonville, GA
Filter papers<
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Olimp, Shinjuku, Japonia	Olympus 1x70
Normalna surowica kozia	Sigma, St. Louis, MO
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO
Chlorek potasu	Sigma, St. Louis, MO
Fosforan diwodorofosforanu potasu	Sigma, St. Louis, MO
Azydek sodu	Sigma, St. Louis, MO
Chlorek sodu	Sigma, St. Louis, MO
Wodorotlenek sodu	EMD Millipore, Burlington, MA
Sodowy pentobarbital	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Triton-X-100	Sigma, St. Louis, MO
Xylene	VWR,Radnor, PA

td style='kolor-tła:#ffffff;przepełnienie:ukryte;wypełnienie:0px 3px;wyrównanie w pionie:dół;'> td style='kolor tła:#ffffff;kolor:#1a202c;rodzina czcionek:Arial;rozmiar czcionki:10pt;grubość czcionki:normalny;przepełnienie:ukryte;wypełnienie:0px 3px;wyrównanie w pionie:dół;biały-spacja:normalny;zawijanie słów:break-word;strategia-zawijania:4;'>Fisher scientific, Pittsburgh, PA