Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej

Abstract

Źródło: Jongbloets, B. C., et al. Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje procedurę mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej do wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachłanających głowę podczas wymuszonej lokomocji.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. In Vivo Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej

1. Rozpocznij obrazowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej (2pFLIM) w ciągu 2 tygodni po instalacji okna czaszkowego lub później. Zminimalizuj zakłócenia eksperymentalne spowodowane stresem poprzez częste manipulowanie myszą i drapanie jej przed rozpoczęciem badania obrazowego w celu przyzwyczajenia myszy.
2. Ustaw długość fali lasera wzbudzenia dwufotonowego na 960 nm za pomocą oprogramowania sterującego laserem dwufotonowym.
3. Znieczulij mysz za pomocą 4% izofluranu. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, szczypiąc ogon i obserwując częstość oddechów. Oznacza to, że nie powinno być żadnej reakcji na uszczypnięcie ogona, a częstość oddechów powinna zostać zmniejszona do ~1 oddechu na sekundę. Aby zminimalizować niepotrzebny czas zabiegu i ponieważ znieczulenie trwa tylko dwie do trzech minut, nie stosuje się smarków do oczu.
4. Przenieś znieczuloną mysz do zmotoryzowanej bieżni (Rysunek 1C) i zamontuj nagłówek myszy do uchwytu płyty czołowej zestawu bieżni (patrz Rysunek 1 po szczegóły). Oczyść powierzchnię szkiełka nakrywkowego z szybą czaszki myszy za pomocą 70% etanolu.
5. Umieść zmotoryzowaną bieżnię z zamontowaną myszą pod obiektywem 2pFLIM. Nałóż kroplę wody destylowanej między szkiełko nakrywkowe na szybę czaszki a obiektyw.
6. Pozwól zamontowanej myszy obudzić się ze znieczulenia i zaaklimatyzować się w środowisku bieżni i mikroskopu przez co najmniej 10 minut. Monitoruj częstość oddechów myszy, gdy zamontowana mysz budzi się ze znieczulenia.
7. Udać się do miejsca wstrzyknięcia w świetle epi-oświetlenia. Udokumentuj cechy referencyjne (tj. naczynia krwionośne) w jasnym polu, aby pomóc w obrazowaniu tego samego obszaru zainteresowania (ROI) podczas kolejnych sesji obrazowania.
8. Wyeliminuj wszelkie przychodzące światło inne niż emitowane światło z tkanki mózgowej. Wyłącz źródło światła epi-illumination i zamknij obudowę zestawu 2pFLIM. Aktywuj 2pFLIM PMT, włączając sprzętowe sterowanie napięciem poleceń.
9. Uzyskaj obraz 2pFLIM ze stosu z użyciem oprogramowania do akwizycji 2pFLIM FLIMimage z następującymi zalecanymi ustawieniami do obrazowania tAKARα-dodatnich somatów u obudzonych myszy. Ustaw uśrednianie klatek na 3 klatki, prędkość skanowania na 2 ms/linię, rozmiar obrazu na 128 x 128 pikseli, a pole widzenia na 90−100 μm. Dostosuj ustawienia obrazowania w zależności od przygotowania i konfiguracji sprzętowej.
10. Sprawdź uzyskany obraz w widoku FLIM (opracowane przez nas oprogramowanie na zamówienie). Dostosuj ustawienia obrazowania zgodnie z krokiem 1.9, aby zoptymalizować liczbę fotonów i zminimalizować fotowybielanie.

UWAGA: Działająca zintegrowana liczba fotonów w ROI do obrazowania w czasie życia tAKARα-dodatniej somy in vivo wynosi ~1,000−10,000 fotonów w zależności od amplitudy sygnału, która wynika z określonego bodźca.

1. Użyj zmniejszonego pola widzenia, zmniejszonej prędkości skanowania, zwiększonej mocy lasera i zwiększonej liczby klatek do uśrednienia, aby zwiększyć liczbę zintegrowanych fotonów i zmniejszyć błąd oszacowania czasu życia. Jednocześnie upewnij się, że używasz minimalnej niezbędnej mocy lasera, uśredniania klatek i prędkości skanowania, aby zminimalizować fotowybielanie.
2. Obraz w regularnych odstępach czasu (np. co 30−60 s) poprzez powtórzenie akwizycji stosu z ustawieniami określonymi w kroku 1.10. Pobieraj podstawowe obrazy 2pFLIM przez co najmniej 15 minut przy zerowej prędkości bieżni.
3. Ustaw prędkość obrotową bieżni na ~15 cm/s na 15 minut podczas pozyskiwania obrazów 2pFLIM. Kontynuuj obrazowanie przez ≥20 minut po wyłączeniu rotacji bieżni, aby ocenić czas trwania aktywności PKA po ustaniu wymuszonej lokomocji.
   

2. Analiza obrazów 2pFLIM

1. Otwórz uzyskane obrazy w FLIMview i ustaw następujące parametry w FLIMview.

1. Kliknij pola minimalnego i maksymalnego zakresu zliczania pojedynczych fotonów (SPC) w FLIMview. Wprowadź odpowiednią minimalną i maksymalną wartość zakresu SPC, zwykle w zakresie odpowiednio 1,2−2 i 10−12 ns.

2. Kliknij na pole wartości t₀ w FLIMview i wprowadź wartość t₀ (zazwyczaj ~2 ns). Kliknij pole minimalnej wartości progowej luminancji w czasie życia w FLIMview i wprowadź żądaną wartość progową do 5−30 fotonów.

2. Kliknij przycisk nowej grupy (N) i przypisz nazwę grupy eksperymentalnej. Spowoduje to wygenerowanie grupy, która łączy dane z każdego dodanego obrazu FLIM.

3. Kliknij na ROI w module Roi Controls FLIMview i narysuj ROI wokół tAKARα-dodatniej somy. Zmniejsz zakres z-stack, przesuwając dolny i górny z-limit w suwakach z-stack Control w FLIMview, aby zminimalizować zanieczyszczenie sygnału pochodzącego z fotonów tła na innych głębokościach z.

4. Kliknij przycisk +, aby dodać obraz FLIM do grupy (krok 2.2). Kliknij przycisk Calc, aby obliczyć średni czas życia (LT, zwany również średnim czasem emisji fotonów [MPET]), dla zwrotu z inwestycji i błędu oszacowania czasu życia (δτ).

5. Otwórz następny plik z chronologicznej serii obrazowania 2pFLIM. Powtórz krok 2.4. Pamiętaj, aby dostosować położenie zakresu ROI i z-stack, aby zmierzyć tę samą tAKARα-dodatnią somę w czasie, ponieważ z czasem może dojść do dryfu tkanki.

6. Wybierz deltaMPET/MPET₀ w menu rozwijanym modułu Kontrolki grupy. Kliknij pole baseline# i wprowadź indeksy (np. 1 2 3 4 5 dla pierwszych pięciu obrazów w grupie utworzonej w kroku 2.3). Spowoduje to zdefiniowanie obrazów używanych do obliczania czasu życia linii bazowej (LT₀).

7. Kliknij na Plot, aby wygenerować wykres zawierający odpowiedź FLIM (ΔLT/LT₀) tAKARα podczas eksperymentu w zdefiniowanych ROI. Znormalizowane zmiany czasu życia (ΔLT) poszczególnych ROI przez odpowiadający im czas trwania linii bazowej (LT₀) pozwalają na porównanie aktywności PKA podczas lokomocji w różnych ROI.

Results

Materials