Trójwymiarowa wizualizacja zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej myszy

Streszczenie

Źródło: Zaeck, L., et al. Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem. J. Vis. exp. (2019).

Ten film pokazuje proces przygotowania i obrazowania tkanki mózgowej myszy zakażonej wirusem wścieklizny (RABV) w celu oceny postępu infekcji. Przedstawiono w nim kluczowe etapy, w tym barwienie tkanek za pomocą markerów fluorescencyjnych, odwodnienie, oczyszczanie i montaż do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, których kulminacją jest wygenerowanie trójwymiarowej reprezentacji.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

Zastosowano zakażony RABV, utrwalony paraformaldehydem (PFA) zarchiwizowany materiał mózgu.

OSTRZEŻENIE: Protokół ten wykorzystuje różne substancje toksyczne i/lub szkodliwe, w tym PFA, metanol (MeOH), nadtlenek wodoru (H₂O₂), azydek sodu (NaN₃), {{TAG_42}tert-butanol (TBA), alkohol benzylowy (BA), benzoesan benzylu (BB) i eter difenylowy (DPE). MeOH i TBA są wysoce łatwopalne. Unikaj narażenia, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne) i przeprowadzając eksperymenty w dygestorium. Odpady należy zbierać oddzielnie do odpowiednich pojemników i utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami. Wirus wścieklizny jest klasyfikowany jako patogen o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2 i dlatego może być zasadniczo traktowany w warunkach BSL-2. Niektóre działania, w tym procedury, które mogą generować aerozole, pracować z wysokimi stężeniami wirusów lub pracować z nowymi lyssawirusami, mogą wymagać klasyfikacji BSL-3. Profilaktyka przedekspozycyjna jest zalecana dla personelu wysokiego ryzyka, w tym opiekunów zwierząt i pracowników laboratoriów. Zapoznaj się z przepisami władz lokalnych.

1. Utrwalenie tkanki mózgowej i sekcjonowanie

1. Utrwal próbki mózgu w odpowiedniej objętości 4% PFA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS [pH 7,4]) przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4 °C (z przybliżonym stosunkiem tkanki do utrwalacza 1:10 [v/v]).
2. Próbki tkanek przemywać 3 razy w PBS przez co najmniej 30 minut każde płukanie i przechowywać je w 0,02% NaN₃/PBS w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
3. Pokrój tkankę na odcinki o grubości 1 mm za pomocą wibratomu (szybkość posuwu ostrza: 0,3–0,5 mm/s, amplituda: 1 mm, grubość warstwy: 1 000 μm).
4. Aby zachować prawidłową sekwencję plastrów, przechowuj każdy fragment tkanki oddzielnie w studzience wielodołkowej płytki do hodowli komórkowej. Dodać 0,02% NaN₃/PBS i przechowywać skrawki tkanek w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

2. Wstępna obróbka próbki metanolem

UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji należy wykonywać z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Wstępna obróbka próbki służy ogólnemu celowi, jakim jest poprawa dyfuzji przeciwciał i zmniejszenie autofluorescencji tkanek poprzez ekspozycję na MeOH i H₂O₂.

1. Przygotuj 20% (v/v), 40%, 60% i 80% roztwory MeOH w wodzie destylowanej. Na przykład, aby uzyskać 20% MeOH, dodaj 10 ml 100% MeOH do 40 ml wody destylowanej w odpowiednim szczelnym naczyniu i wymieszaj, odwracając je.
2. Przenieść próbki do naczyń o odpowiedniej wielkości (np. probówek reakcyjnych o pojemności 5 ml). Zadbaj o to, aby używać materiałów odpornych chemicznie na odczynniki stosowane w tym protokole. Na przykład zauważ, że podczas gdy polipropylen jest odpowiedni, polistyren nie.
   UWAGA: Specyfikacje objętości w tym protokole odnoszą się do probówek reakcyjnych o pojemności 5 ml. Jeśli używane jest inne naczynie, odpowiednio dostosuj objętość.
3. Inkubować próbki w 4 ml każdego stężenia przygotowanej serii roztworów MeOH w porządku rosnącym przez 1 godzinę każda.
4. Inkubować próbki 2x przez 1 godzinę każda w czystym (100%) MeOH.
5. Schłodzić próbki do temperatury 4°C (np. w chłodziarce nadającej się do użytku laboratoryjnego).
6. Przygotuj roztwór wybielający (5% H₂O₂ w MeOH), na przykład rozcieńczając 30% H₂O₂ roztworu podstawowego w stosunku 1:6 in czysty (100%) MeOH i schłodzić w temperaturze 4 °C.
7. Usuń 100% MeOH ze schłodzonych próbek i dodaj 4 ml wstępnie schłodzonego roztworu wybielającego (5% H₂O₂ w MeOH). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
8. Roztwór wybielający należy wymienić na 4 ml 80% MeOH i inkubować przez 1 godzinę. Kontynuować stosowanie przygotowanych serii roztworów MeOH w porządku malejącym przez 1 godzinę każdy, aż próbki będą inkubowane przez 1 godzinę w 4 ml 20% MeOH.
9. Przemyć próbki 1x przez 1 godzinę 4 ml PBS.

3. Barwienie immunologiczne

UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji należy wykonywać z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów, dodaj NaN₃ do końcowego stężenia 0,02% do roztworów w tej sekcji. Próbki tkanek są dodatkowo przepuszczalne przez obróbkę niejonowymi detergentami Triton X-100 i Tween 20. Normalna surowica służy do blokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał. Glicyna i heparyna są dodawane w celu zmniejszenia tła znakowania immunologicznego.

1. Próbki przemyć 2x po 1 h w 4 ml 0,2% Triton X-100/PBS.
2. Próbki należy przepuszczać przez 2 dni w temperaturze 37 °C za pomocą 4 ml 0,2% Triton X-100/20% dimetylosulfotlenku (DMSO)/0,3 M glicyny/PBS.
3. Zablokuj niespecyficzne wiązanie przeciwciał poprzez inkubację próbek przez 2 dni w temperaturze 37 °C w 4 ml 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% normalnej surowicy/PBS.
   UWAGA: Użyj normalnej surowicy tego samego gatunku, w której wyhodowano przeciwciało drugorzędowe, aby osiągnąć idealne wyniki blokowania.
4. Próbki inkubować w 2 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (3% normalna surowica/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 z heparyną] + pierwszorzędowe przeciwciało/przeciwciała) przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Odświeżyć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego po 2,5 dnia.
   1. W przypadku PTwH rozpuścić sól sodową heparyny w wodzie destylowanej w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml (roztwór ten należy przechowywać w porcjach w temperaturze 4 °C). Dodać roztwór podstawowy do 0,2% Tween 20/PBS do końcowego stężenia 10 μg/ml.
      UWAGA: Wybór odpowiedniego rozcieńczenia przeciwciał może wymagać optymalizacji. Ogólnie rzecz biorąc, dobrym punktem wyjścia są standardowe stężenia immunohistochemiczne.
5. Próbki należy myć przez 1 dzień w 4 ml PTwH, wymieniając bufor do płukania co najmniej 4–5 razy w ciągu dnia i pozostawiając końcowe płukanie na noc.
6. Próbki inkubować w 2 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych (3% normalna surowica/PTwH + przeciwciało/przeciwciała drugorzędowe) przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Odświeżyć roztwór przeciwciała drugorzędowego po 2,5 dnia.
   1. Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało/przeciwciała w stosunku 1:500 w roztworze przeciwciała drugorzędowego (tj. 4 μl w 2 ml).
7. Myć próbki przez 1 dzień zgodnie z opisem w kroku 3.5, pozostawiając końcowe mycie na noc.

4. Barwienie jądrowe

UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji należy wykonywać z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Jeśli barwienie jądrowe nie jest wymagane lub długość fali wzbudzenia/widmo emisyjne czerwieni tiazolowej (TO-PRO-3) jest wymagane do wzbudzenia lub wykrycia innego fluoroforu, należy pominąć ten krok.

1. Rozcieńczyć barwienie kwasem nukleinowym TO-PRO-3 w stosunku 1:1,000 w PTwH i inkubować próbki w 4 ml roztworu do barwienia jądrowego przez 5 godzin.
2. Umyj próbki przez 1 dzień, jak opisano w kroku 3.5, pozostawiając ostatnie płukanie na noc.
   UWAGA: Po przemyciu próbki można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C aż do oczyszczenia optycznego.

5. Oczyszczanie tkanek

UWAGA: Wszystkie etapy inkubacji należy wykonywać z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Próbki tkanek są odwadniane w stopniowanej serii roztworów TBA. Ponieważ barwienie immunologiczne wymaga roztworów wodnych, wszystkie procedury barwienia muszą zostać zakończone przed usunięciem tkanek. Dopasowanie klirensu optycznego i współczynnika załamania światła uzyskuje się poprzez leczenie mieszaniną BA, BB i DPE. Roztwór oczyszczający jest uzupełniony o DL-α-tokoferol jako przeciwutleniacz.

1. Przygotuj 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% i 96% roztwory TBA w wodzie destylowanej. Na przykład, aby uzyskać 30% TBA, dodaj 15 ml 100% TBA do 35 ml wody destylowanej w odpowiednim zamykanym naczyniu i wymieszaj przez odwrócenie.
   UWAGA: TBA ma temperaturę topnienia 25–26 °C; W związku z tym ma tendencję do bycia stałym w temperaturze pokojowej. Aby przygotować roztwory TBA, należy podgrzać dobrze zamkniętą butelkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub łaźni wodnej.
2. Odwodnić próbki po 4 ml każdego stężenia z przygotowanej serii roztworów TBA w porządku rosnącym przez 2 godziny każda. Pozostaw 96% TBA na noc.
3. Odwodnić próbki dalej w czystym (100%) TBA przez 2 godziny.
4. Przygotuj roztwór czyszczący BABB-D15.
   UWAGA: BABB-D15 to kombinacja BA i BB (BABB), która jest mieszana z DPE w stosunku x:1, gdzie w nazwie roztworu określono x jest określone w nazwie roztworu, W tym przypadku 15.
   1. W przypadku BABB wymieszaj jedną część BA z dwiema częściami BB.
   2. Wymieszaj BABB i DPE w proporcji 15:1.
   3. Dodać 0,4% obj. DL-α-tokoferolu (witaminy E).
      UWAGA: Na przykład w przypadku 20 ml BABB-D15 wymieszaj 6,25 ml BA z 12,5 ml BB. Dodać 1,25 ml DPE i uzupełnić go 0,08 ml DL-α-tokoferolu.
5. Próbki należy oczyścić w roztworze klarującym, aż staną się optycznie przezroczyste (2–6 godzin).
6. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w BABB-D15, chronione przed światłem, do czasu montażu i obrazowania.

6. Przykładowy montaż

1. Za pomocą drukarki 3D wydrukuj komorę obrazowania i pokrywę (materiał: kopoliester [CPE], dysza: 0,25 mm, wysokość warstwy: 0,06 mm, grubość ścianki: 0,88 mm, liczba ścianek: 4, wypełnienie: 100%, brak konstrukcji nośnej).
2. Zmontuj komorę obrazowania (Rysunek 1).
   1. Zamontuj okrągłe szkiełko nakrywkowe (średnica: 30 mm) na komorze obrazowania z gumy silikonowej RTV-1 (jednoskładnikowa wulkanizacja w temperaturze pokojowej). Usuń nadmiar gumy silikonowej wacikiem zwilżonym wodą i utwardź przez noc.
   2. Zamontuj okrągłe szkiełko nakrywkowe (średnica: 22 mm) na wieczku z gumy silikonowej RTV-1. Usuń nadmiar gumy silikonowej wacikiem zwilżonym wodą i utwardź przez noc.
3. Umieść próbkę w komorze obrazowania, dodaj niewielką objętość BABB-D15 i włóż pokrywkę. Napełnij komorę BABB-D15 przez wlot za pomocą igły podskórnej (27 G x 3/4 cala [0,40 mm x 20 mm]).
4. Zatkać wlot i uszczelnić komorę obrazowania gumą silikonową RTV-1. Utwardzać przez noc w ciemności.

7. Obrazowanie i przetwarzanie obrazu

1. Skonfiguruj akwizycję obrazu, wybierając odpowiednie linie laserowe pasujące do użytych fluoroforów. Dostosuj zakresy wykrywania każdego detektora, aby zapobiec nakładaniu się sygnału między kanałami.
   UWAGA: Przykładowe zakresy wykrywania dla Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 i TO-PRO-3 to odpowiednio 500–550 nm, 590–620 nm i 645–700 nm.
2. Wybierz parametry akwizycji, zdefiniuj górną i dolną granicę stosu z i uzyskaj stos obrazów.
   UWAGA: Przykładowe parametry akwizycji to skan sekwencyjny o rozmiarze piksela 60-90 nm, rozmiar kroku z 0,5 μm, średnia liniowa 1, prędkość skanowania 400 Hz i rozmiar otworka 1 jednostka Airy.
3. Przetwarzaj stos obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (np. Fidżi) w celu wygenerowania projekcji 3D lub przeprowadzenia dogłębnych analiz.
   UWAGA: Ze względu na duży rozmiar pozyskiwanych plików graficznych, zwykle konieczne jest użycie stacji roboczej.
   1. Otwórz plik (pliki) pobierania lub obrazu na Fidżi (Plik |{ {TAG_589}} Otwórz | Wybierz pliki).
      1. Jeśli korzystasz na przykład z plików LIF, zaznacz lub odznacz żądane opcje w oknie dialogowym Bio-Formaty. Wyświetlanie stosu za pomocą Hyperstack. Poza tym nie są konieczne żadne konkretne wybory ani znaczniki. Naciśnij OK.
      2. Jeśli plik zawiera wiele stosów obrazów, wybierz te, które mają być analizowane i potwierdź, naciskając OK.
   2. Wykonaj korekcję wybielania, dzieląc scalony obraz na poszczególne kanały (Image |{ {TAG_645}} Kolor | Narzędzie Channels, a następnie wybierz Więcej | Podziel kanały). Dla każdego kanału wybierz korekcję wybielania (Image | TDostosuj | Korekta wybielania) i wybierz Prosty stosunek (intensywność tła: 0.0).
      UWAGA: W niektórych przypadkach, na przykład, gdy nie ma liniowego zaniku sygnału lub sygnał jest ogólnie zbyt słaby, Prosty stosunek może się nie powieść. Możesz też spróbować Dopasowanie wykładnicze lub pomiń korektę wybielacza.
   3. Dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału za pomocą suwaków (Obraz |{ {TAG_724}} Dostosuj | Jasność | Contrast).
   4. Scal kanały (Image |{ {TAG_754}} Kolor | Połącz kanały), utwórz kompozyt (Obraz | Kolor | Narzędzie do kanałów, następnie wybierz Więcej | Make Composite{), i przekonwertuj go do formatu RGB (Obraz | Kolor | Kanały Tool, a następnie wybierz Więcej | Konwertuj na RGB).
   5. W razie potrzeby zmień rozmiar stosu obrazów, aby skrócić czas obliczeń i rozmiar pliku (Image | TDostosuj | Rozmiar, Obie opcje są zaznaczone plus interpolacja dwuliniowa).
   6. Wygeneruj projekcję 3D (Obraz | Stosy | Projekt 3D). Wybierz Brightest Point jako metodę projekcji i ustaw odstępy między warstwami tak, aby odpowiadały rozmiarowi kroku z uzyskanego stosu obrazów. Aby uzyskać maksymalną jakość, ustaw przyrost kąta obrotu na 1 i włącz interpolację. W razie potrzeby zmodyfikuj całkowity obrót, progi przezroczystości i krycie.
   7. W razie potrzeby dostosuj kontrast i jasność, konwertując projekcję 3D z powrotem na format 8-bitowy (Image | Type | 8-bit). Użyj odpowiednich suwaków (Obraz | Ustaw | Jasność | Contrast) i ponownie przekonwertuj stos obrazów na format RGB zgodnie z opisem w kroku 7.3.4.
   8. Zapisz projekcję 3D jako . Plik TIF (format pliku obrazu) i plik .AVI (format pliku wideo).

Wyniki

Materiały