Wykorzystanie reflektometrii spektralnej do określenia zmielinizowanych średnic aksonów w nieruchomym wycinku mózgu myszy

Streszczenie

Źródło: Kwon, J., et al., Spektralna mikroskopia reflektometryczna na mielinowanych aksonach in situ. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje zastosowanie reflektometrii spektralnej z hiperspektralnym mikroskopem konfokalnym do analizy wzorców interferencji i określania mielinowych średnic aksonów w utrwalonych wycinkach tkanki mózgowej.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Kalibracja

1. Włączyć mikroskop co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem, aby umożliwić stabilizację termiczną źródła lasera (patrz Tabela materiałów). Następnie włącz oprogramowanie do skanowania spektralnego (patrz Tabela materiałów) i kliknij przycisk Acquire w górnej części GUI (graficzny interfejs użytkownika) (Rysunek 1a).
2. Włącz migawkę oprogramowania dla lasera światła białego (WLL) i lampy fotopowielacza (PMT) (Rysunek 1a).
3. Wybierz tryb xyΛ z listy rozwijanej w trybie akwizycji, a następnie tryb wprowadzania lasera zostanie automatycznie zmieniony ze stałego procentu na stałą moc. Odznacz pole wyboru Automatyczny ruch SP. Następnie ustaw okno widmowe lasera wejściowego na 470–670 nm, a rozmiar kroku widmowego na 4 nm w ustawieniach skanowania lambda wzbudzenia λ (Rysunek 1b).
4. USTAW zakres spektralny PMT na 450-690nm, klikając dwukrotnie lub przesuwając pasek regulacji zakresu widmowego (Rysunek 1c).
   Uwaga: Ten zakres spektralny powinien obejmować pełne pasmo źródła wejściowego.
5. Wybierz soczewkę obiektywową zanurzoną w wodzie, odpowiednio o dużej aperturze numerycznej (NA > 0,7) i podaj dowolną wartość PMT i mocy lasera, aby aktywować AOBS () konfiguracji i przycisku Live Scan. Przełącz ścieżkę optyczną, sprawdzając odbicie w konfiguracji AOBS (Rysunek 1d).
6. Zamontuj lustro referencyjne (patrz Tabela materiałów) na stoliku mikroskopu. Powierzchnia lustra powinna być skierowana w stronę soczewki obiektywu. Jeśli nie jest łatwo zamontować lustro na stoliku mikroskopu, przymocuj lustro do płaskiej płytki (e.g., szkło szkiełkowe).
7. Kontroluj stolik mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej z powierzchnią lustra.
8. Dostosuj wzmocnienie PMT i moc lasera, biorąc pod uwagę zakres dynamiczny detektora, a następnie zmień tryb wprowadzania lasera ze stałego procentu na stałą moc.
   Uwaga: Jak to zwykle bywa, przy 570 nm stosuje się wzmocnienie PMT 500 (V) i względną moc lasera 0,1%.
9. Potwierdź w trybie pseudokolorowym, aby sprawdzić, czy nie ma nasycenia w całym zakresie długości fali. Jeśli zaobserwuje się nasycenie, zmniejsz moc lasera (rysunek 1a).
10. Uruchom pobieranie skanowania lambda.
11. Zdejmij lustro ze stolika i powtórz tę samą akwizycję bez próbki, aby uzyskać ciemne odniesienie (i.e., ciemne przesunięcie).
12. Zapisz dane w formacie wielostosowym TIF.

2. SpeRe (Reflektometria spektralna) Pozyskiwanie obrazu

1. Umieść zamontowaną tkankę na stoliku mikroskopu. Aby z grubsza wyrównać tkankę z płaszczyzną ogniskową soczewki obiektywu, użyj trybu fluorescencji szerokokątnej przez okular.
2. Przy włączonym Skanowanie na żywo kontroluj stolik mikroskopu, aby wyrównać płaszczyznę ogniskowej do interesującego obszaru tkanki. Aby uniknąć szumu tła z szkiełka nakrywkowego, wybierz obszar docelowy o głębokości co najmniej 15 μm z granicy faz szkło-chusteczka.
3. Uzyskaj stos obrazów spektralnych dla obszaru docelowego, stosując tę samą procedurę, jak opisano w krokach 1.1–1.10.
4. Zapisz dane dla tkanki i ciemnego offsetu w formacie Multistacked TIF.
   Uwaga: Eksperymentator może na tym etapie zrobić pauzę.

3. Przetwarzanie i analiza obrazu

1. Otwórz dane spektralne (wielowarstwowy TIF) dla lustra referencyjnego i tkanki mózgowej w ImageJ.
2. Wybierz ROI (obszary zainteresowania) dla otwartych stosów obrazów — centralny obszar dla lustra referencyjnego i segment włókna aksonowego dla tkanki mózgowej.
3. Uzyskaj surowe widma dla wybranych ROI, uruchamiając Image → Stacks{{}} → Wykres profilu osi Z w menu ImageJ.
4. Otwórz dane z ciemnego przesunięcia, jedno wykonane dla lustra referencyjnego, a drugie dla tkanki mózgowej.
5. Uzyskaj widma dla ciemnych przesunięć, uruchamiając Image → Stacks → Wykres profilu osi Z w menu ImageJ.
6. Zapisz wszystkie uzyskane widma, korzystając z opcji Kopiuj i wklej.
   Uwaga: W przypadku obrazowania SpeRe zaleca się użycie centralnego pola obrazowania w celu zminimalizowania aberracji optycznych poza osią. Włókna aksonów mogą być strukturalnie niejednorodne na całej swojej długości. W związku z tym zaleca się wybranie zwrotu z inwestycji w małym segmencie aksonu, zwykle < 5 μm, w celu zminimalizowania artefaktu częściowej objętości.

Wyniki

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Obiektyw apochromatyczny 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	Typ zanurzenia w wodzie.
Zieleń fluoromyelinowa	Thermo Fisher	F34651
Leica SP8 TCS mikroskop	Leica Microsystems	SP8
Oprogramowanie do obrazowania	Leica Microsystems	LAS-X
Matlab	MathWorks
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	Pokryty chronionym srebrem.
Szkiełko nakrywkowe	Thermo Fisher	3306	Grubość: #1 (0,13 do 0,17 mm).
Szkło szkiełkowe	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Grubość: ~1 mm.
Super klej	Henkel	Loctite 406	Używaj urządzenia dozującego, aby uniknąć kontaktu ze skórą lub oczami.
Laser światła białego	NKT photonics	EXB-6	EXB-6 został wycofany i zastąpiony przez EXU-6.

{{TAG_ 48}}