Wizualizacja projekcji neuronów ruchowych i rozgałęzień aksonów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego

Abstract

Source: < style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'>Liau, E. S. et al. Wizualizacja motorycznej nawigacji aksonów i kwantyfikacja arboryzacji aksonów w zarodkach myszy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą lekkiej mikroskopii fluorescencyjnej. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego do obrazowania projekcji neuronów ruchowych i rozgałęziania aksonów transgeniczne zarodki myszy. Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem próbki, obrazowaniem i rekonstrukcją 3D rozgałęzień aksonalnych w celu oceny wzrostu i łączności neuronów ruchowych.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały poddane przeglądowi i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego (LSFM) (2–3 h)

1. Przykładowa konfiguracja
   1. Ustaw optykę 5X/0,1 i optykę detekcyjną 5X/0,16. Zamontuj uchwyt na próbkę i kapilar próbki (średnica wewnętrzna 1,5 mm, kolor zielony) i umieść je w mikroskopie.
      UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby uzyskać szczegółowe procedury konfiguracji.
   2. Zamontuj zarodek w następujący sposób:
      1. Przygotuj końcówkę pipety P200, odcinając górną część tak, aby pasowała do średnicy kapilary i usuń spiczastą część (~ 3 mm) do mocowania próbki.
      2. Rozpuść stępiony koniec końcówki pipety za pomocą małego płomienia.
      3. Zgaś płomień i szybko przymocuj zarodek pionowo do stopionego końca.
      4. Dopasuj górną część końcówki pipety do kapilary próbki.
   3. Pozwól, aby bufor komory zrównoważył się z zarodkiem przez 1 minutę, aby usunąć zanieczyszczenia lub pęcherzyki.
   4. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, wybierz Zlokalizuj kapilarę pod Znajdź zakładkę i dostosuj osie x, y i z, aby ustawić kapilarnę próbki.
   5. Wybierz Zlokalizuj próbkę i powiększ do 0,6x, aby ustawić ostrość na zarodku. Obróć zarodek, aby upewnić się, że długa oś obrazowanej kończyny pokrywa się z torem światła dwóch źródeł światła (Rysunek 1B).
2. Akwizycja obrazu
   1. W sekcji Akwizycja zdefiniuj parametry ścieżki światła, takie jak cele detekcji, filtr blokujący laser, rozdzielacz wiązki, kamery i lasery.
      UWAGA: W tym eksperymencie użyto kanału białka zielonej fluorescencji (GFP) (długość fali wzbudzenia: 488 nm; filtr emisyjny: pasmowoprzepustowy (BP) 505 do 545 nm; rozdzielacz wiązki: SPS LP 560).
   2. Zaznacz pole wyboru skanowania w pozycji pivot, aby zmniejszyć cień.
   3. Zdefiniuj ustawienia akwizycji: głębia bitowa, 16 bitów; zoom, 0,36-0,7x; Oświetlenie jednostronne (lewy/prawe) lub dwustronne.
   4. Kliknij Continuous i ustaw intensywność lasera, czas ekspozycji, moc lasera i pozycję arkusza świetlnego, aby uzyskać ostrzejsze obrazy.
      UWAGA: Moc lasera jest utrzymywana na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować fotouszkodzenia.
   5. Naciśnij STOP , aby zakończyć pobieranie obrazu.
3. Akwizycja wielowymiarowa
   1. Zdefiniuj stos z, przesuwając pozycję Z dla pierwszego i ostatniego obrazu. Kliknij Optimal , aby ustawić numer wycinka.
   2. Kliknij Rozpocznij eksperyment, aby uzyskać wybrany z-stack.
   3. Po zakończeniu zapisz obraz w formacie .czi.
4. Przetwarzanie obrazu (opcjonalnie)
   1. Kontynuuj z Fuzja dwustronna pod kanałem Przetwarzanie arkusza świetlnego jeśli zastosowano dwustronne oświetlenie. Przetwarzanie multiviewjest to konieczne, jeśli uzyskuje się wiele widoków w celu łączenia obrazów pod różnymi kątami.
   2. Utwórz obraz 2D, korzystając z danych z pikseli o największej intensywności wzdłuż osi projekcji w kanale Projekcja maksymalnej intensywności.
   3. W kanale Copy kliknij Subset, aby wybrać podzbiory obrazów z oryginalnego zestawu.

2. Kwantyfikacja arboryzacji aksonów (30 minut dla każdego nerwu z osobna)

1. Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do analizy obrazowania (domyślnie obraz zawierający dane XYZ jest otwierany w trybie Surpass i jako widok renderowany w 3D).
2. Dostosuj kolor, jasność i kontrast obrazu za pomocą okna Display Adjustment (Edytuj | Pokaż Korektę Wyświetlania) do wykrywania włókien na podstawie lokalnego kontrastu intensywności.
3. Kliknij ikonę Dodaj nowe filamenty i wybierz z rozwijanego menu Autopath (bez pętli) algorytm.
4. Wybierz obszar zainteresowania (w tym przypadku akson segmentacji zainteresowania). Kliknij Następny po zakończeniu.
5. Zdefiniuj punkty początkowe i początkowe, przypisując największe i najcieńsze wymiary średnicy, które można zmierzyć za pomocą trybu Slice .
6. Przypisz punkt początkowy na krawędzi obszaru zainteresowania. Aby uzyskać ręczne dodawanie lub usuwanie punktów początkowych, najpierw zmień tryb wskaźnika (Nawiguj | Wybierz), a następnie Shift + kliknięcie prawym przyciskiem myszy w punktach zainteresowania.
7. Wybierz ręczne progi dla punktów wysiewu, aby upewnić się, że cała widoczna arboryzacja jest zaznaczona. Zmiana trybu wskaźnika (Nawiguj | Wybierz), a następnie Shift + lewy przycisk myszy w miejscach zainteresowania, aby ręcznie dodać lub usunąć punkty początkowe.
   UWAGA: Ważne jest, aby ręcznie usunąć szumy tła i sygnały z sąsiednich nerwów.
8. Zaznacz pole Usuń punkty początkowe wokół punktów początkowych.
9. Sprawdź Usuń rozłączone segmenty , aby umożliwić wykluczenie punktów, które są zbyt daleko i mogą reprezentować szum tła. W następnym kroku wskaż w następnym kroku, aby określić górną granicę wykluczenia.
10. Dostosuj próg odejmowania tła, który wykorzystuje filtr Gaussa do oszacowania intensywności tła każdego woksela.
11. Ustaw automatyczny próg średnicy dendrytu za pomocą algorytmu Przybliż powierzchnię przekroju.
12. Pomiń kroki obliczania kręgosłupa.
13. Zakończ proces i wybierz żądany styl i kolor.
14. Odznacz pole woluminu w Properties , aby wyświetlić tylko zrekonstruowane aksony.
15. W zakładce Statistics wybierz Detailed. Użyj Nr filamentu. Punkty końcowe dendrytów do ilościowego określenia zakończeń nerwu ruchowego jako wskaźnika arboryzacji aksonów ruchowych.
    UWAGA: W razie potrzeby można dodać adnotację statystyczną.
16. Wyeksportuj obraz zrekonstruowanego aksonu jako plik .tif.

Results

Materials