Opisano metodę witryfikacji zarodków myszy opartą na glikolu etylenowym. Jest ona korzystniejsza od innych metod ze względu na prostotę i niską toksyczność dla zarodków, dzięki czemu może znaleźć szerokie zastosowanie u wielu szczepów myszy, w tym u myszy inbredowych i modyfikowanych genetycznie.
Artykuł metodologiczny
Kriokonserwacja embrionów myszy metodą witryfikacji z użyciem glikolu etylenowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kriokonserwacja zarodków myszy stanowi podstawę technologiczną wspierającą nauki biomedyczne, ponieważ dzięki modyfikacjom genetycznym stworzono wiele szczepów myszy, a ich liczba systematycznie wzrasta z roku na rok. Rozwój techniczny tej dziedziny rozpoczął się od metod powolnego mrożenia w latach 70. XX wieku1, a następnie nastąpił rozwój metod witryfikacji opracowanych pod koniec lat 80.2. Zazwyczaj ta druga technika jest korzystniejsza ze względu na szybkość, prostotę oraz wysoką przeżywalność odzyskanych zarodków. Jednak zawarte w niej krioprotektanty są wysoce toksyczne i mogą wpływać na późniejszy rozwój zarodka. W związku z tym technika ta nie znajdowała zastosowania w przypadku niektórych szczepów myszy, nawet gdy roztwory schładzano do 4°C, aby złagodzić efekt toksyczny podczas manipulacji zarodkami. W RIKEN BioResource Center utrzymywanych jest ponad 5000 szczepów myszy o różnych podłożach genetycznych i fenotypach3, dlatego zoptymalizowaliśmy technikę witryfikacji, która pozwala nam kriokonserwować zarodki wielu różnych szczepów myszy, zapewniając wysoką przeżywalność zarodków po witryfikacji i rozmrażaniu (a dokładniej upłynnianiu) w temperaturze otoczenia4.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę witryfikacji embrionów myszy, która została z sukcesem zastosowana w naszym ośrodku. Roztwór do krio konserwacji zawiera glikol etylenowy zamiast DMSO, aby zminimalizować toksyczność dla embrionów5. Zawiera on również Ficoll w celu zapobiegania dewitryfikacji oraz sacharozę do regulacji osmotycznej. Embriony można przetwarzać w temperaturze pokojowej i przenieść do ciekłego azotu w ciągu 5 min. Ponieważ oryginalna metoda została zoptymalizowana pod kątem plastikowych słomek jako pojemników, nieznacznie zmodyfikowaliśmy protokół dla kriotubek, które są łatwiej dostępne w laboratoriach i bardziej odporne na uszkodzenia mechaniczne. Szczegółowo opisujemy również procedurę rozmrażania witryfikowanych embrionów, ponieważ jest to krytyczny etap dla efektywnego odzyskania żywych myszy. Metodologie te będą pomocne badaczom i technikom, którzy potrzebują bezpiecznego i kosztowo efektywnego sposobu konserwacji szczepów myszy do późniejszego wykorzystania.
Protokół
Ogólny schemat eksperymentu przedstawiono na Rys. 1.
1. Przygotowanie odczynników
- Przygotuj pożywkę podstawową (zwaną tutaj PB1) w szklanej butelce o pojemności 10 ml zgodnie z poniższą tabelą:
massa molowa mM mg/100 ml NaCl 58.4 136.98 800.0 KCl 74.6 2.68 20.0 KH2PO4 136.1 1.47 20.0 Na2HPO (hematoksylina i eozyna)4.12H2O 358.14 8.04 288.1 MgCl₂2,6H2O 203.3 0.49 10.0 Glukoza 180.2 5.56 100.0 Pirowinian 110 0.33 3.6 CaCl22,2H2O 147 0.9 13.2 Penicylina G 6,0 (w przybliżeniu) - Przygotowanie roztworu Ficoll-sucroza (FS):
- Do 14 ml roztworu PB1 w probówce o pojemności 50 ml dodać następujące odczynniki chemiczne.
Ficoll 70 6,0 g Sacharoza 3,424 g BSA 42,0 mg - Wymieszać Ficoll 70 i sacharozę w roztworze PB1, a następnie dokładnie wstrząsnąć do całkowitego rozpuszczenia.
- Po upewnieniu się, że powyżej nastąpiło całkowite rozpuszczenie, należy dodać BSA na powierzchnię roztworu i przechowywać go w temperaturze 4°C aż do całkowitego rozpuszczenia BSA (> 4 godziny lub przez noc).
- Do 14 ml roztworu PB1 w probówce o pojemności 50 ml dodać następujące odczynniki chemiczne.
- Przygotować roztwór równoważący (EFS20) oraz roztwór witryfikacyjny (EFS40) w probówce o pojemności 50 ml:
- EFS20: 20%(v/v) glikolu etylenowego, 24% (w/v) Ficollu i 0,4 mol/L sacharozy w PB1 z BSA
- EFS40: 40% (v/v) glikolu etylenowego, 18% (w/v) Ficollu oraz 0,3 mol/L* sukroza w PB1 z BSA
*W przypadku zarodków z linii BALB/c lub ICR należy zwiększyć stężenie sacharozy do 0,9 mol/l, ponieważ są one bardziej podatne na uszkodzenia kriogeniczne.6.
roztwór EFS20 roztwór EFS40 Glikol etylenowy 1 ml 2 ml roztwór FS 4 ml 3 ml - Sterylizować roztwór poprzez filtrację, używając 0.45 μm przefiltrować. Przygotować alikwoty w polistyrenowych probówkach o pojemności 5 ml i przechowywać w 4°CMożna ich używać przez około 6 miesięcy.
- Przygotowanie roztworu do rozmrażania zarodków zawierającego 0,75 M sacharozy (TS1)
- Rozpuścić 7,7 g sacharozy w PB1 (przygotowanym w kroku 1.1) i doprowadzić objętość całkowitą do 30 ml. Mieszać przez delikatne potrząsanie do całkowitego rozpuszczenia sacharozy.
- Nanieść 90 mg BSA na powierzchnię roztworu i pozostawić do całkowitego rozpuszczenia.
- Sterylizować roztwór poprzez filtrację.
- Podzielić na alykwoaty i przechowywać w temperaturze 4°CMożna ich używać przez około 1 miesiąc.
Uwaga: TS1 można również przygotować z dostępnego komercyjnie M2.
- Rozpuścić 7,7 g sacharozy w M2 i doprowadzić całkowitą objętość do 30 ml.
- Mieszać, delikatnie wstrząsając, aż sacharoza całkowicie się rozpuści.
- Sterylizować roztwór poprzez filtrację.
- Rozdzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze 4°C. Można ich używać przez około 1 miesiąc.
- TS2 (roztwór do rozmrażania zawierający 0,25 M sacharozy):
- Rozcieńczyć 10 ml TS1 w 20 ml PB1 lub M2, w zależności od potrzeb.
- Podzielić na alykwoaty i przechowywać w temperaturze 4°CMożna ich używać przez około 1 miesiąc.
2. Witryfikacja zarodków myszy w stadium 2 komórek
- Przygotować zarodki myszy w stadium 2 komórek poprzez kojenie naturalne lub konwencjonalne techniki zapłodnienia in vitro.
- Odmierzyć 50 μl EFS40 do probówki kriogenicznej. Dalsze etapy procedury witryfikacji należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
- Nanieść 50 μl EFS20 na dno plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm lub 60 mm.
- Przenieść do 30 zarodków do EFS20 za pomocą szklanej kapilary, używając minimalnej ilości medium hodowlanego. Włączyć stoper na 2 min.
Uwaga: Zarodki należy umieścić na dnie kropli, co zapewni ich efektywne odwodnienie. Sprawdzić morfologię zarodków pod stereomikroskopem. Odwodnione zarodki wykazują obkurczoną morfologię, jak pokazano na Rys. 2A. Jeśli nie są one wystarczająco odwodnione, odczekać dodatkowe 1 lub 2 min. - W około 1,5 min pobrać zarodki z kropli EFS20, używając minimalnej ilości roztworu. Przenieść je do EFS40 w probówce kriogenicznej przygotowanej w kroku 2.1. Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy dostosować czas pobierania zarodków tak, aby wszystkie zarodki zostały przeniesione do EFS40 w okolicach 2 min.
- Odczekać 1 min.
- Włożyć probówkę kriogeniczną bezpośrednio do ciekłego azotu (LN2).
3. Rozmrażanie witryfikowanych zarodków myszy w stadium 2 komórek
- Przed rozmrażaniem przygotuj płytkę z kroplami po 10 μl pożywki do hodowli zarodków dla odzyskiwanych zarodków (patrz krok 3.13). Przykryj płytkę olejem i umieść w inkubatorze CO2 do czasu użycia. Uwaga: Choć w tym eksperymencie można stosować dowolne pożywki do rutynowej hodowli zarodków, zalecamy pożywki o wyższej osmolarności, takie jak pożywka M16.
- Podgrzej TS1 do 37°C.
- Załóż maskę ochronną i rękawice kriogeniczne. Otwórz zbiornik LN2 i wyjmij krioprobówkę zawierającą zarodki.
- Szybko otwórz górną część probówki i wylej LN2. Odczekaj 30 s, aby zapobiec zamarznięciu TS1 w następnym kroku.
- Za pomocą pipety 100ul dodaj do probówki 850 μl TS1 (37°C) i wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując (około dziesięciu razy w ciągu 25 sekund), aż roztwór zostanie równomiernie rozpuszczony.
- Przenieś całą objętość z probówki na plastikową płytkę Petriego o średnicy 60 mm (lub szkiełko zegarkowe) (Rys. 3A). Uwaga: Zarodkami należy operować w temperaturze pokojowej (2-25°C) aż do momentu umieszczenia ich w inkubatorze CO2 w kroku 3.14.
- Uruchom czasomierz na 3 min.
- Po około 2 min w TS1 delikatnie potrząśnij płytką, aż pożywka zawierająca zarodki rozprzestrzeni się po powierzchni płytki (Rys. 3B). Uwaga: Pomoże to zarodkom opaść na dno, ponieważ po przeniesieniu do TS1 unoszą się one w pobliżu powierzchni.
- Nanieś na płytkę trzy krople TS2 po 50 μl (Rys. 3C).
- Po 3 min w TS1 sprawdź morfologię zarodków za pomocą stereomikroskopu; powinny być lekko obkurczone. Zobacz morfologię zarodków na wcześniejszym etapie (Rys. 2B) i późniejszym etapie (Rys. 2C) w TS1. Uwaga: Jeśli zarodki są nadal obrzęknięte, pozostaw je w TS1 na kolejne 1 do 3 min.
- Pobierz zarodki i przenieś je do pierwszej kropli TS2 (Rys. 3D). Uruchom czasomierz na 3 min.
- Po 3 min przenieś zarodki do drugiej, a następnie do trzeciej kropli (Rys. 3E).
- Przenieś zarodki do pożywki hodowlanej przygotowanej w kroku 3.1. Zarodki mają kształt przedstawiony na Rys. 2D.
- Umieść płytkę w inkubatorze CO2. Około 10 min później przenieś zarodki do kolejnej kropli pożywki hodowlanej, aby wypłukać sacharozę przeniesioną z TS2.
- Kontynuuj hodowlę w inkubatorze CO2 do czasu transferu zarodków.
Uwaga: Przenieś zarodki do jajowodów samic biorczyń w dniu rozmrażania. Długa hodowla in vitro może zmniejszyć żywotność zarodków u niektórych szczepów myszy.
4. Reprezentatywne wyniki:
In vitro oraz in vivo-rozwój zarodków po rozmrożeniu przedstawiono w tabelach 1 i 2. Zaletami niniejszego protokołu są wysoka przeżywalność zarodków po rozmrożeniu oraz jego szeroka stosowalność w odniesieniu do różnych szczepów myszy.
| Szczep | Całkowita liczba probówek | Liczba witryfikowanych zarodków | Odzyskane (Liczba (%)) | Morfologicznie prawidłowe (Liczba (%)) | Rozwój do blastocyst (liczba (%)) |
| C57BL/6J | 20 | 400 | 397 (99) | 394 (99) | 342 (87) |
| BALB/cA | 15 | 300 | 296 (99) | 282 (95) | 238 (84) |
| ICR | 24 | 480 | 474 (99) | 443 (93) | 398 (90) |
Tabela 1. Rozwój in vitro embrionów rozmrożonych po witryfikacji u powszechnie stosowanych szczepów myszy
| Stan zarodków | Liczba samic biorców | Liczba transferowanych embrionów | Miejsca implantacji (liczba (%)) | Żywe potomstwo (liczba (%)) |
| Świeże | 12 | 180 | 141 (78.3) | 110 (61.1) |
| Szkłowaty | 16 | 242 | 202 (83.5) | 125 (51.7) |
Tabela 2. Rozwój in vivo witryfikowanych i rozmrożonych zarodków u myszy C57BL/6J.
Rycina 1. Ogólny schemat eksperymentu, obejmujący równoważenie, witryfikację i rozmrażanie zarodków.
Rysunek 2. Morfologia embrionów na każdym etapie rozmrażania.
Rysunek 3. Procedura rozmrażania zarodków. Wszystkie procedury są wykonywane w temperaturze pokojowej. (A), Dodać 850 μl TS1 (37°C) do probówki kriogenicznej, a następnie całą objętość roztworu z probówki przenieść na plastikową płytkę. Na tym etapie embriony wyglądają na obrzękłe, co przedstawiono w Ryc. 2B(B) Rozprowadzić roztwór po powierzchni płytki poprzez delikatne potrząsanie. (C) Umieścić trzy 50 μl krople medium TS2 na plastikową szalkę. (D) Przenieść zarodki do pierwszej kropli TS2. Po 3 minutach zarodki wyglądają na skurczone, co pokazano na Ryc. 2C(E), Przenosić je szeregowo do pozostałych kropli TS2, a następnie do pożywki hodowlanej.
Dyskusja
Od czasu pierwszej doniesienia o witryfikacji zarodków myszy opublikowanej przez Ralla i Fahy'ego w 1985 roku2, wprowadzono szereg ulepszeń technicznych w celu zwiększenia przeżywalności zarodków po rozmrażaniu. Jedną z najskuteczniejszych modyfikacji było zastosowanie glikolu etylenowego jako krioprotektanta ze względu na jego niską toksyczność i wysoką przenikalność przez błony komórkowe. Zalety te pozwalają na manipulowanie mrożonymi zarodkami w temperaturze pokojowej4; inne metody witryfikacji wymagają pracy z zarodkami w niższych temperaturach i nie zawsze znajdują zastosowanie u niektórych szczepów myszy, w tym BALB/c6. Pierwszą metodę witryfikacji opartą na glikolu etylenowym opracowali Kasai i wsp. w 1990 roku5,7. Ponieważ oryginalna metoda została zoptymalizowana pod kątem zastosowania plastikowych słomek jako pojemników, nieco zmodyfikowaliśmy protokół dla krioprobek, które są łatwiej dostępne w laboratoriach i bardziej odporne na uszkodzenia mechaniczne. W związku z tym opisana tutaj metoda witryfikacji może znaleźć zastosowanie w wielu laboratoriach wykorzystujących myszy jako modele badawcze. Tą samą metodą można mrozić zarodki myszy w stadium moruli i blastocysty8 oraz zarodki szczura9. Odkryliśmy jednak niedawno, że jakość krioprobek może wpływać na przeżywalność zarodków po zamrażaniu i rozmrażaniu. Dlatego przed witryfikacją zarodków niezbędne jest sprawdzenie gładkości wewnętrznej powierzchni krioprobek (np. patrz w Tabeli odczynników i sprzętu).
Metody witryfikacji mają wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi metodami powolnego mrożenia, lecz wykazują one naturalną wadę w odniesieniu do celów transportowych. Ponieważ witryfikowane embriony powinny być przechowywane w temperaturze poniżej -120°C w celu zachowania ich żywotności, do ich bezpiecznego transportu zazwyczaj stosuje się kontenery transportowe typu dry shipper. Kontenery te są ciężkie i nieporęczne, a ich transport w obie strony jest kosztowny, zwłaszcza w przypadku przesyłek międzynarodowych. Obecnie opracowujemy nową metodę witryfikacji, dzięki której witryfikowane embriony mogą być przechowywane w temperaturze suchego lodu (około -80°C) przez co najmniej 7 dni10. Metoda ta powinna stanowić witryfikację nowej generacji.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badanie to zostało przeprowadzone we współpracy z National BioResource Project oraz Ministerstwem Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Albumin surowicy bydlęcej | Merck & Co., Inc. | 12657 | |
| Glikol etylenowy | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 058-00986 | |
| Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
| Glukoza | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| NaCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 191-01665 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 500-04195 | |
| MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-00165 | |
| CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 031-00435 | |
| Penicylina G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
| Pirowinian sodu | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
| Sacharoza | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-00015 | |
| Pożywka M16 | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| Pożywka M2 | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Kriotubka | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-4501 | “Probówka kriogeniczna” |
Bibliografia
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
- Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
- Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
- Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
- Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
- Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Kriokonserwacja zarodk w myszywitryfikacja glikolem etylenowymprocedura rozmra ania zarodk wprzechowywanie w ciek ym azocieprzygotowanie medium do witryfikacjiprze ywalno zarodk wobchodzenie si z krioprob wkamimedium o wysokiej osmolarno ciprotok transferu zarodk wredukcja toksyczno ci krioprotektant w
