Kriokonserwacja zarodków myszy za pomocą witryfikacji na bazie glikolu etylenowego

Podsumowanie

Opisano metodę witryfikacji mysich zarodków na bazie glikolu etylenowego. Jest korzystna w stosunku do innych metod ze względu na swoją prostotę i niską toksyczność embrionalną, a zatem może być szeroko stosowana do wielu szczepów myszy, w tym myszy wsobnych i zmodyfikowanych genowo.

Streszczenie

Kriokonserwacja embrionów myszy jest technologiczną podstawą wspierającą nauki biomedyczne, ponieważ wiele szczepów myszy zostało wytworzonych przez modyfikacje genetyczne, a liczba ta stale rośnie z roku na rok. Jego rozwój techniczny rozpoczął się od metod powolnego zamrażania w latach siedemdziesiątych^{XX wieku 1 ,} a następnie metod witryfikacji opracowanych pod koniec lat osiemdziesiątych^{XX wieku 2} . Ogólnie rzecz biorąc, ta ostatnia technika jest korzystna ze względu na szybkość, prostotę i wysoką przeżywalność odzyskanych zarodków. Jednak zawarte w nich krioprotektanty są wysoce toksyczne i mogą wpływać na późniejszy rozwój zarodka. W związku z tym technika ta nie miała zastosowania do niektórych szczepów myszy, nawet gdy roztwory są schładzane do 4°C w celu złagodzenia toksycznego działania podczas obchodzenia się z zarodkami. W RIKEN BioResource Center utrzymywanych jest ponad 5000 szczepów myszy o różnym pochodzeniu genetycznym i fenotypach³, dlatego zoptymalizowaliśmy technikę witryfikacji, za pomocą której możemy kriokonserwować zarodki wielu różnych szczepów myszy, z korzyściami w postaci wysokiej przeżywalności zarodków po zeszkleniu i rozmrożeniu (lub upłynnieniu, dokładniej) w temperaturze otoczenia⁴.

Tutaj prezentujemy metodę witryfikacji zarodków myszy, która została z powodzeniem zastosowana w naszym centrum. Roztwór do krioprezerwacji zawiera glikol etylenowy zamiast DMSO, aby zminimalizować toksyczność dla zarodków⁵. Zawiera również filol i sacharozę, które zapobiegają odpowiednio dewitryfikacji i regulacji osmotycznej. Zarodki można obchodzić się w temperaturze pokojowej i przenieść do ciekłego azotu w ciągu 5 minut. Ponieważ pierwotna metoda została zoptymalizowana pod kątem plastikowych słomek jako pojemników, nieznacznie zmodyfikowaliśmy protokół dla krioprobówek, które są łatwiej dostępne w laboratoriach i bardziej odporne na uszkodzenia fizyczne. Szczegółowo opisujemy również procedurę rozmrażania zeszklonych zarodków, ponieważ jest to kluczowy krok dla skutecznego odzyskiwania żywych myszy. Metodologie te byłyby pomocne dla badaczy i techników, którzy potrzebują konserwacji szczepów myszy do późniejszego wykorzystania w bezpieczny i opłacalny sposób.

Protokół

Ogólny schemat eksperymentu jest pokazany na Rys. 1.

1. Przygotowanie odczynnika

1. Przygotuj podłoże bazowe (tutaj znane jako PB1) w szklanej butelce o pojemności 100 ml zgodnie z poniższą tabelą:   M.W. Mm mg/100ml Zawartość NaCl 58,4 pkt. Klasa 136,98 TGL 800.0 Kcl 74,6 pkt. Godzina 2,68 20,0 TGL KH₂PO₄ 136,1 pkt. Pytanie 1,47 20,0 TGL Na₂HPO 4.12H₂O 358,14 TGL Godzina 8.04 288,1 szt. MgCl 2,6H2 O 203,3 pkt. 0,49 pkt. Wersja 10.0 glukoza Poziom 180,2 Klasa 5,56 100,0 Na pirogronian Rozdział 110 0,33 pkt. 3.6 CaCl_{2,2H 2}O Rozdział 147 0,9 Rozdział 13,2 Penicylina G     6,0 (w przybliżeniu)
2. Przygotuj roztwór figolu i sacharozy (FS):
   1. Dodać następujące substancje chemiczne do 14 ml roztworu PB1 w probówce o pojemności 50 ml. Fikol 70 6,0 gr sacharoza 3,424 grama Bsa 42,0 mg tabletki powlekania
   2. Wymieszaj Ficoll 70 i sacharozę w roztworze PB1 i dobrze wstrząśnij, aż do całkowitego rozpuszczenia.
   3. Po sprawdzeniu całkowitego rozpuszczenia powyżej, dodać BSA na powierzchnię roztworu i utrzymywać go w temperaturze 4oC aż do całkowitego rozpuszczenia BSA (> 4 godziny lub przez noc).
3. Przygotować roztwór równoważący (EFS20) i roztwór do witryfikacji (EFS40) w probówce o pojemności 50 ml:
   • EFS20: 20%(v/v) glikol etylenowy, 24% (w/v) Ficoll i 0,4 mol/l sacharozy w PB1 z BSA
   • EFS40: 40%(v/v) glikol etylenowy, 18% (w/v) Ficoll i 0,3 mol/L^* sacharoza w PB1 z BSA
     ^*W przypadku zarodków ze szczepu BALB/c lub ICR należy zwiększyć stężenie sacharozy do 0,9 mol/l sacharozy, ponieważ są one bardziej wrażliwe na kriouszkodzenia⁶.
     Rozwiązanie EFS20 Rozwiązanie EFS40 Glikol etylenowy Pojemność 1 ml Pojemność 2 ml Rozwiązanie FS Pojemność 4 ml Pojemność 3 ml
4. Wysterylizuj roztwór przez filtrację przy użyciu filtra 0,45 μm. Porcje należy przygotować w probówkach z polistyrenu o pojemności 5 ml i przechowywać w temperaturze 4°C. Można je stosować przez około 6 miesięcy.
5. Przygotowanie roztworu do rozmrażania zarodków zawierającego 0,75 M sacharozy (TS1)
   1. Rozpuścić 7,7 g sacharozy w PB1 (przygotowanej w kroku 1.1) i doprowadzić całkowitą objętość do 30 ml. Mieszać delikatnie wstrząsając, aż sacharoza całkowicie się rozpuści.
   2. Dodać 90 mg BSA na powierzchnię roztworu i pozostawić do całkowitego rozpuszczenia.
   3. Wysterylizuj roztwór przez filtrację.
   4. Porcję i przechowywać w temperaturze 4°C. Można je stosować przez około 1 miesiąc.
   
   Uwaga: TS1 można również przygotować z dostępnego na rynku M2.
   
   6. Rozpuścić 7,7 g sacharozy w M2 i doprowadzić całkowitą objętość do 30 ml.
   7. Mieszaj delikatnie potrząsając, aż sacharoza całkowicie się rozpuści.
   8. Wysterylizuj roztwór przez filtrację.
   9. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze 4oC. Można je stosować przez około 1 miesiąc.
6. TS2 (roztwór do rozmrażania zawierający 0,25 M sacharozy):
   1. Rozcieńczyć 10 ml TS1 w objętości 20 ml PB1 lub M2, w zależności od przypadku.
   2. Porcję i przechowywać w temperaturze 4°C. Można je stosować przez około 1 miesiąc.

2. Witryfikacja 2-komórkowych zarodków myszy

1. Przygotuj 2-komórkowe zarodki myszy za pomocą naturalnego krycia lub konwencjonalnych technik zapłodnienia in vitro.
2. Podaniec 50 μl EFS40 do krioprobówki. Następnie należy wykonać pozostałą część procedury witryfikacji w temperaturze pokojowej.
3. Podwielokrotność 50 μl EFS20 na dnie plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm lub 60 mm.
4. Przenieść do 30 zarodków do EFS20 za pomocą szklanej kapilary z minimalną ilością pożywki hodowlanej. Uruchom minutnik na 2 min.
   Uwaga: Umieść zarodki na dnie kropli. To sprawia, że skuteczne odwadnianie zarodków. Sprawdź morfologię zarodków za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Odwodnione zarodki wykazują skurczoną morfologię, jak pokazano na ryc. 2A. Jeśli nie są wystarczająco odwodnione, odczekaj więcej 1 lub 2 minuty.
5. Po około 1,5 minuty pobrać zarodki z kropli EFS20, popijając tylko minimalną ilość roztworu. Przenieś je do EFS40 w krioprobówce przygotowanej w kroku 2.1. Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, dostosuj czas pobierania zarodków tak, aby wszystkie zarodki mogły zostać przeniesione do EFS40 po około 2 minutach.
6. Odczekaj 1 minutę.
7. Umieść krioprobówkę bezpośrednio w ciekłym azocie (LN₂).

3. Rozmrażanie zeszklonych 2-komórkowych zarodków myszy

1. Przed rozmrożeniem należy przygotować naczynie z 10 μl kropli pożywki do hodowli zarodków dla odzyskanych zarodków (patrz krok 3.13). Przykryj naczynie olejem i umieść w inkubatorze CO₂ do czasu użycia. Uwaga: Chociaż w tym eksperymencie można użyć dowolnych pożywek do rutynowej hodowli zarodków, zalecamy pożywki o wyższej osmolarności, takie jak pożywka M16.
2. Ciepły TS1 do 37°C.
3. Załóż maskę na twarz i kriorękawiczki. Otwórz zbiornik LN₂ i wyjmij krioprobówkę zawierającą zarodki.
4. Szybko otwórz górną część probówki i wyrzuć LN₂. Odczekaj 30 sekund, aby zapobiec zamarznięciu TS1 w następnym kroku.
5. Za pomocą pipety 1000ul dodaj 850 μl TS1 (37°C) do probówki i mieszaj roztwór delikatnymi pipetami (około dziesięć razy w ciągu 25 sekund), aż roztwór zostanie równomiernie rozpuszczony.
6. Przenieść całą objętość probówki na plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm (lub szkiełko zegarkowe) (rys. 3A). Uwaga: Zarodki należy obchodzić się w temperaturze pokojowej (22-25°C) do momentu umieszczenia ich w inkubatorze CO₂ w kroku 3.14.
7. Uruchom minutnik na 3 minuty.
8. Po około 2 minutach w TS1 delikatnie potrząśnij naczyniem, aż podłoże zawierające zarodki rozprowadzi się na powierzchni naczynia (ryc. 3B). Uwaga: Pomoże to zarodkom zejść na dno, ponieważ unoszą się one blisko powierzchni po przeniesieniu do TS1.
9. Umieść trzy krople TS2 o pojemności 50 μl na naczyniu (rys. 3C).
10. Po 3 minutach w TS1 sprawdzić morfologię zarodków pod mikroskopem stereoskopowym; powinny być one lekko skurczone. Zobacz morfologię zarodków we wcześniejszej (ryc. 2B) i późniejszej (ryc. 2C) w TS1. Uwaga: Jeśli zarodki są nadal spuchnięte, trzymaj je w TS1 dłużej niż 1 do 3 minut.
11. Zebrać zarodki i przenieść je do pierwszej kropli TS2 (Fig. 3D). Uruchom minutnik na 3 minuty
12. Po 3 minutach przenieś zarodki do drugiej kropli, a następnie do trzeciej kropli (ryc. 3E).
13. Przenieść zarodki do pożywki hodowlanej przygotowanej w kroku 3.1. Zarodki są w kształcie pokazanym na ryc. 2D.
14. Umieścić naczynie w inkubatorze CO₂ . Około 10 minut później przenieś zarodki do następnej kropli pożywki hodowlanej, aby wypłukać sacharozę, która została przeniesiona z TS2.
15. Kontynuować hodowlę w inkubatorze CO2 do momentu transferu zarodków.
    Uwaga: Przenieś zarodki do jajowodów samic biorczyni w dniu rozmrożenia. Długa hodowla in vitro może zmniejszyć żywotność zarodków u niektórych szczepów myszy.

4. Reprezentatywne wyniki:

Rozwój in vitro i in vivo zarodków po rozmrożeniu jest przedstawiony w tabelach 1 i 2. Zaletami tego protokołu są wysoka przeżywalność zarodków po rozmrożeniu oraz jego szerokie zastosowanie u różnych szczepów myszy.

naprężać Całkowita liczba rur Liczba zarodków poddanych witryfikacji Odzyskany (No. (%)) Morfologicznie normalne (No. (%)) Rozwój do blastocyst (No. (%)) Zobacz materiał C57BL/6J 20 400 szt. 397 (99) 394 (99) 342 (87) BALB/cA 15 300 szt. 296 (99) 282 (95) 238 (84) Stan inwentarza 24 480 szt. 474 (99) 443 (93) 398 (90)

Tabela 1. Rozwój in vitro zarodków poddanych witryfikacji i rozmrożeniu u popularnych szczepów myszy

Stan zarodków Liczba samic biorców Liczba przeniesionych zarodków Miejsca implantacji (nr (%)) Żywe potomstwo (nr. (%)) świeży 12 180 szt. 141 (78,3) 110 (61,1) Zeszklone 16 242 TGL 202 (83,5) 125 (51,7)

Tabela 2. Rozwój in vivo zarodków zamrożonych i zaklętych u myszy C57BL/6J.

Rysunek 1. Ogólny schemat eksperymentu, w tym równoważenie, witryfikacja i rozmrażanie zarodków.

Rysunek 2. Morfologia zarodków na każdym etapie rozmrażania.

Rysunek 3. Procedura rozmrażania zarodków. Wszystkie zabiegi wykonywane są w temperaturze pokojowej. (A), dodać 850 μl TS1 (37°C) do krioprobówki i przenieść całą objętość roztworu w krioprobówce na plastikowe naczynie. W tym czasie zarodki wyglądają na spuchnięte, jak pokazano na ryc. 2B. (B), Rozprowadź roztwór na powierzchni naczynia, delikatnie potrząsając. (C), Umieść trzy krople TS2 o pojemności 50 μl na plastikowym naczyniu. (D), Przenieś zarodki do pierwszej kropli TS2. Po 3 minutach zarodki wyglądają na shurunken, jak pokazano na ryc. 2C. (E), Przenieś je szeregowo do pozostałych kropli TS2, a następnie do pożywki hodowlanej.

Dyskusja

Od czasu pierwszego doniesienia o witryfikacji zarodków myszy przez Ralla i Fahy'ego w 1985 r.² wprowadzono kilka ulepszeń technicznych w celu zwiększenia przeżywalności zarodków po rozmrożeniu. Jedną z najbardziej udanych modyfikacji osiągnięto dzięki zastosowaniu glikolu etylenowego jako krioprotektantu ze względu na jego niską toksyczność i wysoką przepuszczalność błony. Takie zalety pozwalają nam radzić sobie z zamrażaniem zarodków w temperaturze pokojowej⁴; inne metody witryfikacji wymagają oddawania zarodków w niższych temperaturach i nie zawsze mają zastosowanie do niektórych szczepów myszy, w tym BALB/c⁶. Pierwsza witryfikacja na bazie glikolu etylenowego została opracowana przez Kasai i wsp. w 1990 r.^5,7. Ponieważ pierwotna metoda została zoptymalizowana pod kątem plastikowych słomek jako pojemników, nieznacznie zmodyfikowaliśmy protokół dla krioprobówek, które są łatwiej dostępne w laboratoriach i bardziej odporne na uszkodzenia fizyczne. Dlatego opisana tutaj metoda witryfikacji może mieć zastosowanie w wielu laboratoriach wykorzystujących myszy jako modele badawcze. Tę samą metodę można również zastosować do zarodków myszy w stadium⁸ moruli i blastocysty oraz zarodków szczurzych⁹. Jednak ostatnio odkryliśmy, że jakość krioprobówek może wpływać na przeżywalność zarodków po zamrożeniu-rozmrożeniu. Dlatego konieczne jest zbadanie wewnętrznej powierzchni krioprobówek pod kątem jej gładkości przed witryfikacją zarodków (np. patrz Tabela określonych odczynników i sprzętu).

Metody witryfikacji mają wiele zalet w porównaniu z konwencjonalnymi metodami powolnego zamrażania, ale z natury mają wadę w odniesieniu do celu transportowego. Ponieważ zeszklone zarodki powinny być przechowywane w temperaturze poniżej -120°C, aby utrzymać ich żywotność, do ich bezpiecznego transportu zwykle używa się suchych transporterów. Suche spedytory są ciężkie i nieporęczne, a ich podróż w obie strony jest droga, zwłaszcza w przypadku transportu międzynarodowego. Obecnie opracowujemy nową metodę witryfikacji, dzięki której witryfikowane zarodki mogą być przechowywane w temperaturze suchego lodu (około -80°C) przez co najmniej 7 dni¹⁰. Ta metoda powinna być witryfikacją następnego pokolenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej	Merck & Co., Inc.	12657
Glikol etylenowy	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	058-00986
Ficoll 70	GE Healthcare	17-0310-10
Glukoza	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	041-00595
NaCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	191-01665
KCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	163-03545
KH2PO4	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-04245
Na2HPO4· 12H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	500-04195
MgCl2 · 6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-00165
CaCl2 · 2H2O	Wako Pure Chemical Industries, Sp. z o.o.	031-00435
Penicylina G	Sigma-Aldrich	P-4687
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	P-8574
Sacharoza	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	196-00015
M16 średni	Sigma-Aldrich	M7292
M2 średni	Sigma-Aldrich	M7167
Cryotube	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-4501	“ Fiolka kriogeniczna”