Obrazowanie histochemiczne modułów korowych w spłaszczonych wycinkach mózgu

Streszczenie

Source: Lauer, S. M., et al. Wizualizacja modułów korowych w spłaszczonych korach ssaków. (2018)

Ten film pokazuje metodę wizualizacji modułów korowych w spłaszczonych sekcjach mózgu za pomocą barwienia histochemicznego. Wstępnie utrwalone skrawki są traktowane odczynnikiem odcedzającym, który uwydatnia aktywne klastry nerwowe, tworząc ciemne obszary o wysokim kontraście. Po zamontowaniu i odwodnieniu, moduły korowe pojawiają się pod mikroskopem jasnego pola jako ciemne, niejednolite wzory.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Wizualizacja modułów korowych za pomocą barwienia oksydazą cytochromową

UWAGA: Opracowano różne protokoły barwienia do histochemicznego wykrywania aktywności oksydazy cytochromowej. W protokole tym wykorzystuje się siarczan niklu i amonu (NiAS), co skutkuje wyższym kontrastem i lepiej zdefiniowanymi modułami w barwionych obszarach kory mózgowej.

1. Przygotować roztwór do barwienia oksydazy cytochromowej. Na 10 ml roztworu dodać 10 ml buforu kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (0,1 M, pH 7,4), 400 mg sacharozy, 12,5 mg NiAS, 2 mg cytochromu C i 6 mg diaminobenzydyny (DAB).
   UWAGA: DAB i NiAS są rakotwórcze.
   UWAGA: Dodaj DAB tuż przed inkubacją sekcji.
2. Umyj skrawki w buforze HEPES (0,1 M, pH 7,4) na wytrząsarce przez 15 minut.
3. }Inkubuj skrawki w roztworze barwiącym w temperaturze pokojowej na shakerze.
   UWAGA: Obserwuj szybkość barwienia. Jeśli nie ma widocznej reakcji, przejść do inkubacji w temperaturze 37 °C. W zależności od stopnia utrwalenia, barwienie można zaobserwować po 10 minutach lub po kilku godzinach.
4. Zatrzymaj reakcję, dodając 4% paraformaldehydu (PFA); Zapobiega to niepożądanemu ponownemu umieraniu i wzrostowi sygnału tła.
5. Umyj sekcje trzykrotnie za pomocą bufora HEPES przez 10 minut.
6. Zamontuj i wysusz sekcje na szkiełkach podstawowych.
7. Odwodnić sekcje rosnącym rzędem alkoholowym:
   1. Umyj szkiełka w 60% etanolu przez 1 minutę. Myj szkiełka w 80% etanolu przez 1 min. Myj szkiełka w 96% etanolu przez 2 minuty. Myj szkiełka w 100% etanolu przez 3 minuty. Myć szkiełka w izopropanolu przez 5 minut. Myj szkiełka w ksylenie przez 5 minut.
8. Natychmiast dodaj szybko utwardzalny środek i dodaj szkiełko nakrywkowe. Critical: Nie używaj mediów montażowych na bazie wody, ponieważ NiAS zostanie wypłukany i zdegraduje barwienie.
9. Przechowywać skrawki w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Barwienie
Cytochrom c z serca konia	Sigma-Aldrich	C2506
hydrat tetrachlorowodorku 3,3'diaminobenzydyny	Sigma-Aldrich	D5637
HEPES	Carl Roth	9105.4
Podłoże
Eukitt (histochemia)	Sigma-Aldrich	3989
Odwadnianie
Etanol 100%	Carl Roth	9065.3
Etanol 96%	Carl Roth	P075.3
2-Propanol	Carl Roth	6752.4
Substytut ksylenu	Fluka	78475
Urządzenia/narzędzia
Kleszcze Dumont 55 - Inox	Fine Science Tools	11255-20
Kleszcze Dumont 5 - Wskazówka do biologii inox	Narzędzia do nauki o naukach	11252-30
Kleszcze Dumont 5SF - Inox Super Fine Tip	Fine Science Tools	11252-00

oksydazą cytochromowąmontażowe lub zamrażającealkoholu