Analiza komórek odpornościowych w tkankach nerwowych myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Hidmark, A. S., et al. {{}}Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy za pomocą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).

Ten film demonstruje zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w nerwach kulszowych myszy i zwojach korzenia grzbietowego (DRG). Proces ten polega na znakowaniu komórek odpornościowych przeciwciałami znakowanymi fluoroforem i biotyną, stabilizacji i przepuszczalności komórek oraz użyciu markerów fluorescencyjnych do wykrywania cech powierzchni komórki i jąder. Technika ta umożliwia ilościową ocenę heterogeniczności komórek odpornościowych w tkankach nerwowych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glukozy, glutamina, pirogronian)	Thermo	31885023	Źródło tego materiału nie jest ważne
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Typ kolagenazy 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I from bydlęca trzustka I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Surowica cielęca płodu (FCS), inaktywowana termicznie	Sigma-Aldrich	F4135
Przeciwciało przeciwko CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
Przeciwciało przeciwko MHC klasy II, biotynylowane	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
Przeciwciało przeciwko CD45-A647	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206		Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Służy do wykrywania MHCII-biotyny za pomocą CD68-APC i F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Rozcieńczyć w PBS do 50x i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności
Sito dysocjacji komórek - zestaw do mielenia tkanek	Sigma-Aldrich	CD1		Płytki 96-dołkowe w kształcie litery V	Greiner/Sigma	M8185
5ml probówka z okrągłym dnem z polistruenu, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm szalka Petriego	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Cytometr przepływowy	BD Biosciences