Analiza komórek odpornościowych w tkankach nerwowych myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Hidmark, A. S., et al. {{}}Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy za pomocą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).

Ten film demonstruje zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w nerwach kulszowych myszy i zwojach korzenia grzbietowego (DRG). Proces ten polega na znakowaniu komórek odpornościowych przeciwciałami znakowanymi fluoroforem i biotyną, stabilizacji i przepuszczalności komórek oraz użyciu markerów fluorescencyjnych do wykrywania cech powierzchni komórki i jąder. Technika ta umożliwia ilościową ocenę heterogeniczności komórek odpornościowych w tkankach nerwowych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Trawienie nerwu kulszowego i DRG

1. Przygotować pożywkę wytrawiającą (Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco [DMEM], 10 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy [HEPES], 5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 1,6 mg/ml kolagenazy typu 4) uzupełnionej 100 μg/ml deoksyrybonukleazy, i przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Ilość pożywki trawiennej wymagana na mysz (nerwy kulszowe + DRG) wynosi 1 ml. Po przygotowaniu, porcje pożywki wytrawiającej mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
2. Przenieś nerwy kulszowe i DRG z jednej myszy do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 500 μl pożywki wytrawiającej. W przypadku nerwów kulszowych posiekaj materiał na 15-20 kawałków za pomocą nożyczek sprężynowych, a następnie inkubuj zawiesiny tkanek w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 20 minut z delikatnym mieszaniem (≤ 450 obr./min).
3. Kilkakrotnie rozcieraj zawiesinę komórkową przez końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl, aby mechanicznie zdysocjować niecałkowicie strawioną tkankę.
   UWAGA: Jeśli zawiesina jest trudna do miareczkowania, odetnij końcówkę pipety nożyczkami, aby uzyskać tępy koniec. Inkubować zawiesinę tkankową w temperaturze 37 °C przez 20 minut, delikatnie mieszając (≤ 450 obr./min).
4. Powtórzyć rozcieranie przez końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem (≤ 450 obr./min).
5. Przygotować bufor FACS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS] uzupełniona 10% płodową surowicą cielęcą [FCS] i 1 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym [EDTA]) i przechowywać na lodzie. Przepłukać i namoczyć sito ze stali nierdzewnej o rozmiarze oczek 140 μm z buforem do sortowania komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm na lodzie.
   UWAGA: Należy unikać nylonowych filtrów sitowych, ponieważ prowadzi to do znacznej utraty wydajności komórek jądrzastych.
6. Zawiesiny tkankowe należy kilkakrotnie przepuszczać przez filtr sitowy 140 μm, trzymany nad szalką Petriego, tępymi kleszczami, na lodzie. Pobrać zawiesinę komórek z szalki Petriego i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 1,5 ml przechowywanej na lodzie.
7. Przepchnąć niecałkowicie strawioną tkankę, która pozostała na filtrze, przez wielokrotne mieszanie za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl. Przepłukać dwukrotnie filtr sitowy 500 μl buforu FACS i zebrać powstałą zawiesinę komórek na szalce Petriego, aby połączyć ją z zawiesiną komórek z kroku 1.6.
   UWAGA: Jeśli zastosowany cytometr przepływowy jest wrażliwy na zanieczyszczenia, zawiesinę komórek z kroku 1.7 można przepuścić przez filtr sitowy 70 μm; Może to jednak prowadzić do utraty wydajności komórek jądrzastych.
8. Odwirować zawiesiny komórek w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu FACS. Powtórz ten krok prania raz.
9. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 150-350 μl buforu FACS, w zależności od wymaganej liczby barwienia (150 μl buforu FACS na panel barwienia).

2. Barwienie nerwu kulszowego i DRG fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami do cytometrii przepływowej

1. Przenieś 100 μl zawiesiny nerwu kulszowego lub komórki DRG do studzienki w kształcie litery V na 96-dołkowej płytce na lodzie.
   UWAGA: Pojedyncze barwione komórki są niezbędne dla wszystkich stosowanych przeciwciał, ponieważ zapewnią niezbędne kontrole do ustawienia cytometrii przepływowej w odniesieniu do wzmocnień napięcia i kompensacji lampy fotopowielacza (PMT), a także pomogą odróżnić wiązanie specyficzne od niespecyficznego.
2. Zebrać pozostałe zawiesiny komórek (około 50 μl na próbkę) z nerwów kulszowych lub próbek DRG, aby służyły jako niebarwiona kontrola.
3. Odwirować płytkę przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant, odwracając płytkę nad pojemnikiem i wykonując gwałtowny ruch nadgarstka, a następnie delikatnie postukać do sucha w ręczniki papierowe.
4. W przypadku barwienia powierzchniowego ponownie zawiesić każdą z osadów komórkowych w 20 μl buforu FACS zawierającego interesujące przeciwciała (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5,5 i główny kompleks zgodności tkankowej [MHC] klasa II-biotyna) i inkubować, chroniąc przed światłem, na lodzie przez 30 minut.
   UWAGA: (1) Przed użyciem należy określić optymalne rozcieńczenie przeciwciał, wykonując rozcieńczenie seria zgodnie z informacjami o produkcie producenta; (2) Barwienie niespecyficzne można zmniejszyć przez inkubację z blokiem Fc na tym etapie, zgodnie z instrukcjami producenta; oraz (3) barwienie kontrolne izotypu na ogół nie jest wymagane w przypadku stosowania przeciwciał pierwszorzędowych bezpośrednio sprzężonych z fluoroforem i/lub gdy antygen (antygeny) będący przedmiotem zainteresowania wytwarza odrębne populacje.
5. Dodać 130 μl buforu FACS do każdego dołka i odwirować płytkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant zgodnie z poprzednim opisem (krok 2.3) i przemyć osady komórek dwukrotnie 150 μl buforu FACS.
   UWAGA: Jeśli używasz niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego lub przeciwciała pierwszorzędowego sprzężonego z biotyną, można w tym momencie dodać odpowiedni odczynnik wtórny, sprzężony z fluoroforem, i powtórzyć kroki 2.4-2.5. W przypadku tego protokołu streptawidyna-PE/Cy7 lub Streptawidyna-PerCP została użyta do wykrycia MHC klasy II w połączeniu z CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 lub w połączeniu odpowiednio z CD68-APC i F4/80-PE/Cy7.
6. W celu utrwalenia, po ostatnim etapie mycia, ponownie zawiesić granulki komórek w 100 μl 4% paraformaldehydu w PBS (pH 7,4). Inkubować płytkę na lodzie przez 10 minut, a następnie wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant zgodnie z poprzednim opisem (krok 2.3) i przemyć osadki komórek 150 μl buforu FACS.
   Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednie środki ochrony, takie jak rękawice i okulary, etc.
   UWAGA: Ponownie zawiesić granulki komórek w 150 μL buforu FACS i przechowywać w chronionym przed światłem, w temperaturze 4°C przez okres do dwóch dni. Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, należy przejść do kroku 2.11 po odwirowaniu płytki w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. W celu barwienia wewnątrzkomórkowego ponownie zawiesić osady komórek w 150 μl buforu FACS + 0,5% detergentu i inkubować w temperaturze pokojowej, Chroniony przed światłem przez 15 min. Odwirować płytkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant zgodnie z poprzednim opisem (krok 2.3) i przemyć osad komórkowy raz 150 μl buforu FACS + 0,5 % detergentu. Zawiesić osad komórkowy w 20 μl buforu FACS + 0,5% detergentu zawierającego interesujące przeciwciała (CD68-APC, CD206-PE) i inkubować, chroniony przed światłem, w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
8. Dodać 130 μl buforu FACS + 0,5% detergentu do każdego dołka i odwirować płytkę przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant jak poprzednio opisane (krok 2.3) i dwukrotnie przemyć osady komórkowe 150 μl buforu FACS + 0,5 % detergentu.
   UWAGA: Jeśli używasz niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego lub przeciwciała pierwszorzędowego sprzężonego z biotyną, można w tym momencie dodać odpowiedni odczynnik wtórny, sprzężony z fluoroforem i powtórzyć kroki 2,9-2,10.
9. Zawiesić osady komórkowe w 150 μl buforu FACS + 0,5% detergentu i przechowywać w temperaturze 4 °C przed światłem przez okres do dwóch dni.
10. Zawiesić osady komórkowe za pomocą 150 μl buforu FACS + 0,5% detergentu uzupełnionego 5 μg/mL4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Odwirować płytkę o stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant zgodnie z poprzednim opisem (etap 2.3).
11. Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 150 μl PBS i przenieść do odpowiednio oznakowanej probówki FAC. Przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem, do czasu przygotowania do analizy.
    UWAGA: Po ponownym zawieszeniu w PBS komórki powinny zostać przeanalizowane w ciągu kilku godzin, ponieważ DAPI będzie powoli dysocjować od DNA, prowadząc do utraty sygnału.

3. Konfiguracja cytometrii przepływowej i badanie próbek

1. Upewnij się, że cytometr przepływowy jest wyposażony w odpowiednie lasery i/lub zestawy filtrów do pomiaru fluoroforów używanych do barwienia komórek. Można to określić w domyślnej konfiguracji cytometru w systemie. W przypadku tego protokołu komórki analizowano za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w trzy lasery (405 nm, 488 nm i 633 nm) pozwalające na wykrycie ≤ 5 fluoroforów.
2. Wybierz odpowiednie kanały do wykrywania interesujących nas fluoroforów. Wszystkie sygnały fluorescencyjne są najlepiej wykrywane za pomocą wzmocnienia logarytmicznego.
3. Należy wybrać odpowiednie natężenie przepływu dla próbek. Parametr ten może się różnić w zależności od zastosowanego systemu i powinien być określony empirycznie. W przypadku tego protokołu zastosowano natężenie przepływu MED-to-HI (35-60 μL/min), aby zapobiec zatykaniu się igły.
4. Wybierz łączną liczbę zdarzeń/komórek, które mają zostać zebrane w próbce. Minimalna liczba zdarzeń powinna wynosić 1 000 000.
5. Utwórz wykresy punktowe w globalnym arkuszu obszaru rozrzutu bocznego (SSC-A ) w porównaniu z obszarem rozproszenia do przodu (FSC-A), a także dla każdego fluoroforu będącego przedmiotem zainteresowania w porównaniu z FCS-A. Utwórz widok statystyczny, który będzie wyświetlał liczbę zdarzeń i średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla wybranych fluoroforów.
6. Ustaw napięcie kanałów FSC-A i SSC-A w taki sposób, aby najmniejsze komórki mieściły się w lewym dolnym rogu wykresu punktowego. Określ fluorescencję tła i minimalną fluorescencję próbki z niebarwionych kontroli z nerwów kulszowych lub DRG. Określ bramkę nadrzędną (P1) na podstawie wykresu punktowego z kontroli barwienia tylko DAPI.
   UWAGA: To nie jest brama zbiorcza, częściowo ze względu na niejednorodną naturę populacji DAPI+ w obwodowym układzie nerwowym (PNS).
7. Korzystając z wykresów punktowych FSC dla każdego z interesujących fluoroforów, dostosuj napięcia tak, aby komórki niebarwionej kontroli mieściły się w dolnej ćwiartce odpowiednich wykresów punktowych. Bramki są następnie tworzone nad tym obszarem, aby zdefiniować te komórki, które są dodatnie dla każdego z odpowiednich markerów/fluoroforów. Umieszczenie bramy potwierdza się poprzez uruchomienie jednobarwnego sterowania (krok 2.1).
   UWAGA: Kompensacja nakładających się widm emisji może być przeprowadzona w tym momencie lub zastosowana retrospektywnie za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego.
8. Po ustawieniu cytometru przepływowego, zgodnie z opisem, próbki można uruchomić.
9. Po uruchomieniu pozostały materiał próbki można wyrzucić, a pliki FCS można wyeksportować do dalszej analizy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glukozy, glutamina, pirogronian)	Thermo	31885023	Źródło tego materiału nie jest ważne
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Typ kolagenazy 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I from bydlęca trzustka I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Surowica cielęca płodu (FCS), inaktywowana termicznie	Sigma-Aldrich	F4135
Przeciwciało przeciwko CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
Przeciwciało przeciwko MHC klasy II, biotynylowane	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
Przeciwciało przeciwko CD45-A647	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206		Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Służy do wykrywania MHCII-biotyny za pomocą CD68-APC i F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Rozcieńczyć w PBS do 50x i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności
Sito dysocjacji komórek - zestaw do mielenia tkanek	Sigma-Aldrich	CD1		Płytki 96-dołkowe w kształcie litery V	Greiner/Sigma	M8185
5ml probówka z okrągłym dnem z polistruenu, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm szalka Petriego	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Cytometr przepływowy	BD Biosciences